Transcript 4주차_PCR, restriction Enz

4주차
생화학 및 분자생물학실험
Polymerase Chain Reaction
제한효소 처리
Content
1.
-
Purpose
PCR
Restriction enzyme
2.
Introduction & theory
- PCR
- Vector
- Restriction enzyme
3.
Materials & method
Experiment Scheme (gene cloning)
Purpose _ PCR
DNA polymerase 반응을 연속적으로 수행하여 표적 DNA sequence를
증폭해 본다.
Purpose _ Restriction enzyme
Endonuclease와 Exonuclease에 대해서 알아보고, 그 중 type II endonuclease에
속하는 BamHI과 HindIII를 이용하여 vector와 insert에 restriction enzyme처리
를 해본다.
Introduction & theory
1.
-
PCR (polymerase chain reaction)
DNA polymerase 반응을 연속으로 수행하여 표적 DNA를 증폭
세 단계 (denaturation, annealing, extension)로 구성되며, 이를 25-30번 반
복하면서 최고 약 1백만 배까지 template DNA를 증폭
Introduction & theory
Exponential amplify : 236
Introduction & theory
Introduction & theory
 Materials
DNA polymerase
1)
주형 단일 가닥의 DNA에 결합하여 5’ 3’ 방향으로 DNA 복제를 시작
새로 합성된 DNA는 주형에 상보적이며 주형의 짝이 되는 가닥과 동일
①
Taq DNA Polymerase
-
호열세균인 Thermus aquaticus에서 추출 100 ℃정도의 높은 온도에서도 thermo-stable
(PCR 과정 중 DNA가 denaturation되는 94 ℃에서도 안정)
-
일반적으로 사용되는 polymerase (약 60 bp/sec의 속도로 DNA를 합성)
-
5‘→3’ polymerization-dependent exonuclease activity를 가짐
-
3‘→5’ exonuclease activity가 없어 mismatching발생 (No editing function)
-
DNA 합성 후 말단에 A 붙음
Introduction & theory
②
Pfu DNA polymerase / Vent DNA polymerase
- 100 ℃에서도 증식이 가능한 초호열성 고세균인 Pyrococcus furiosus / Thermococcus litoralis
에서 각각 추출, Taq DNA Polymerase 보다 내열성이 높음
- 3’→5’exonuclease 활성이 강해 editing function (proofreading) 가짐
- DNA 합성의 fidelity가 높지만 신장 활성이 약함
- 신장성을 높이기 위해 exonuclease 활성을 제거한 변이체로 시판하기도 함
♣ 사용 목적에 따라 modification한 DNA polymerase가 다양하게 있음
Introduction & theory
2)
DNA primer
- Target region과 상보적 가닥의 각 5’부위 끝 부터 15~30 base pairs까지의 sequences
를 인위적으로 합성한 oligonucleotides
- Primer set : Forward primer와 Reverse primer (DNA의 방향성)
- Oligonucleotide의 결합능력은 일반적으로 Tm value로 나타냄
- Tm (Melting temperature) : DNA가 50%는 hybridize되고, 50%의 해리되었을 때의 온도
<Bolton’s Tm 계산법>
Tm = 81.5+0.41(%GC)-600/L (L = oligonucleotide의 길이) → 예측에 한계가 있다.
Introduction & theory

DNA primer design 조건
a.
Primer의 길이 : 15~20 base pair가 적당함.
b.
Primer 간의 상보성 : 2 개의 primer끼리 annealing하지 않도록 한다.
c.
GC 함량 : GC 함량이 50% 전후로 설계하며 부분적으로 GC 혹은 AT-rich 가 되지 않도록 한다.
d.
Primer 내의 2차 구조 형성되지 않도록 한다.
e.
Tm 값 : 2 개의 primer 간의 Tm값이 근접하도록 설계한다.
f.
농도 : 농도는 0.2~1 μM이 되도록 설정한다.
Introduction & theory
5'-GCAATGGTACGGTACTTCCCTACTTAACCGCCAGTTTCCATACCGGTTCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’
3’-GTTTTCACGTGCGATGAAACGATT-5’
Reverse Primer
Forward Primer
5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’
3'-CGTTGCCATGCCATGAAGGGATGAATTGGCGGTCAAAGGTATGGCCAAGGTTTTCACGTGCGATGAAAGGATT-5’
실험 수업에서 사용하는 primer sequence
Forward primer : 5’-CGCGGATCCATGACCATGATTACGGATTC-3’(BamHI)
Reverse primer : 5’-CCCAAGCTTTTATTTTTGACACCA-3’(HindIII)
Introduction & theory
3)
dNTPs (deoxynucleotides)
Extension시 nucleotide를 제공하고 에너지원으로 사용
20~200 μM일 때 PCR이 효율적으로 진행됨
(mismatch 현상은 dNTP 농도에 강하게 의존)
dNTP 농도를 낮춰야 PCR 특이성과 정확도가 높아짐
(Mg2+농도에 따라 dNTP의 최적농도가 달라지므로 주의)
4)
Template DNA
증폭의 주형, 소량으로 PCR 가능
주형 DNA 양은 PCR에서 105~106 분자에 상당하는 양이 있으면 양호한 결과를 얻을 수 있음
(3×105개의 분자는 human genome DNA에서는 1 ㎍, 효모 DNA에서는 10 ng, 대장균 DNA에
서는 1 ng에 상당함)
Introduction & theory
5)
10X PCR buffer : Reaction시에 변할 수 있는 pH를 일정하게 해준다.
①
Tris-HCl buffer (pH8.3)
②
MgCl2 : Mg2+는 Taq polymerase가 작용하는데 필요한 cofactor. 일반적으로 Mg2+농도가 높
아지면 DNA 합성의 정확도에 영향을 미칠 뿐만 아니라 두 가닥 DNA 변성이 어려워진다.
Taq polymerase는 10 mM MgCl2에 의해 40~50%의 저해를 받으므로 MgCl2를 과잉 첨가하
는 것은 바람직하지 않다.
③
KCl : primer와 target DNA 결합을 돕는다.
④
BSA (bovine serum albumin) : Taq polymerase의 효소 활성을 안정화
Introduction & theory
Insert에는 제한효소 인식부위 존재하지 않음
 제한효소 인식부위를 넣어서 primer design
2 cycle
1 cycle
Introduction & theory
3 cycle
Introduction & theory
2.
Vector
: Clone gene을 운반하는데 사용되는 스스로 복제하는 DNA 분자
1)
세포 내에서 자가복제 (self-replication) 가능
2)
항생제를 이용한 선택 (selection) 가능
: Vector에 존재하는 항생제 저항성 유전자를 이용  DNA의 세포 내 주입 여부 판별 가능
3)
Multiple Cloning Site (MCS)를 이용하여 insert를 삽입 (cloning에 용이)
MCS : 일정부위에 제한효소 절단부위가 밀집된 부분
4)
MCS : 일정부위에 제한효소 절단부위가 밀집된 부분
Vector의 특정 sequence를 이용한 DNA sequencing, 단백질 발현, 정제 가능
5)
Tag : 6X His tag이 있어 단백질 정제 시 활용 가능
Introduction & theory
6)
Vector의 종류
plasmid, bacteriophage, cosmid, phagemid 등
→ plasmid 가 가장 널리 쓰임
< Plasmid >
: 숙주세포의 염색체와 독립적으로 복제하는 DNA 분자
(self-replicatable, extrachromosomal, double stranded, small
circular DNA)
* copy number : 한 세포당 가질 수 있는 plasmid 의 수
대부분의 plasmid는 염색체당 한 개 또는 두 개의 사본을 가
지지만, ColE plasmid의 경우처럼 50개 이상을 가질 수 도 있
다.
Introduction & theory
7)
실험에서 사용하는 Vector : pRSET A
Introduction & theory
8)
실험에서 사용하는 Vector (pRSET A)의 MCS (multiple cloning site)
Introduction & theory
3.
Restriction Enzyme
세균이 바이러스에 감염되었을 때 자신의 DNA를 보
호하고 외래 DNA만을 분해하기 위해서 제한효소와
변형효소 합성
1)
제한효소 : 특정 염기 서열 (인식 부위)에서 두 가
닥 DNA를 절단하는 핵산내부가수분해효소
Cf) 변형효소 : 제한효소와 같은 인식부위의 DNA에
결합하여 DNA를 메틸화시키는 효소
 변형된 세균의 DNA는 자신의 제한효소에 대해 면
역을 갖고 외래 DNA는 파괴됨
Introduction & theory
2)
Nuclease (핵산가수분해효소) : 핵산을 절단하거나 분해하는 효소
①
Exonuclease (핵산말단가수분해효소) : DNA분자 말단에서 Phosphodiester bond를 순
차적으로 가수분해하여 nucleotide를 하나씩 제거하거나 짧은 oligonucleotide를 제거
Introduction & theory
②
Endonuclease (핵산내부가수분해효소) : DNA분자 내에서 phosphodiester bond를 깨고
사슬 중간에서 절단시키는 효소. 대표적인 것이 제한효소 (restriction enzyme)
Introduction & theory
3)
특징
- 제한효소의 3가지 type 중 실험실에서 사용되는 것은 대부분 Type II restriction enzyme으로 인식부위
와 절단부위가 모두 특이성이 있음. 4개~6개의 염기서열 인식
- 제한효소는 발견된 세균의 이름 및 serotype에 따라서 명명
- 제한효소가 인식할 수 있는 부위는 앞으로 읽으나 뒤로 읽으나 염기서열이 같은 모양 (palindrome)
- 잘린 후 DNA 모양은 cohesive end 또는 blunt end가 만들어지므로 목적에 따라 선택
<Type II restriction enzyme의 예>
Introduction & theory
Ex)
(1) EcoRI 효소의 절단 부위 : 5'-overhang cohesive end 형성
5'--GAATTC--3' → 5'—G↓AATTC--3'
3'--CTTAAG--5' 3'--CTTAA↓G--5'
(2) SacI 효소의 절단 부위: 3'-overhang cohesive end 형성
5'--GAGCTC--3' → 5'--GAGCT↓C--3'
3'--CTCGAG--5'
3'--C↓TCGAG--5'
(3) SmaI 효소의 절단 부위: blunt end 형성
5'--CCCGGG--3' → 5'--CCC↓GGG--3'
3'--GGGCCC--5‘
3'--GGG↓CCC--5'
Materials & Methods
1.
2.
3.
4.
PCR (polymerase chain reaction)
Gel extraction
Restriction enzyme 처리 (Vector, Insert )
Agarose gel electrophoresis
PCR (polymerase chain reaction)
: Autoclaved PCR tube에 materials을 넣고 PCR machine을 setting한 후 polymerization한다.
Materials
Stock con.
Final con.
Vol. (μl)
10x buffer
10x
1x
2
dNTP
2.5 mM
0.2 mM
1.6
Template DNA (Insert :
LacZ)
1
1) 10X PCR buffer (100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM
KCl, 15mM MgCl2, 0.01% BSA)
2) 2.5mM dNTP
3) Taq polymerase
4) 100μM Primer(F, R)
5) Template DNA
Primer (F)
20 μM
1 μM
1
Primer (R)
20 μM
1 μM
1
Taq polymerase
1
3’DW (autoclaved)
12.4
Total
20
6) 3’DW(autoclaved)
Initial denaturation : 95℃ 5min
Denaturation : 95℃ 1min ┒
Annealing :
45℃ 1min ┠30cycle
Extension :
72℃ 2min ┛
Final extension : 72℃ 5min
- PCR후 Agarose gel로 확인한다.
Store : 16℃ store
→ 약 2 시간 10 분
Gel extraction
1.
1% agarose gel에 electrophoresis를 진행한다.
2.
Gel extraction kit를 사용하여 insert (LacZ) DNA (size : 3075bp) 를 얻는다.
3.0kbp
Restriction enzyme 처리
<Materials>
10X Reaction buffer, 3’DW(autoclaved), Heating block, Vector(pRSET A), Insert (Lac Z),
BamHI , HindIII, e-tube(autoclaved)
1. Heating block을 37℃ 로 맞춘다.
2. Autoclave된 e-tube에 reaction mixture를 만든다.
(Vector와 Insert를 각각 mix함.)
Materials
3.
Vol. (μl)
10X reaction buffer
1
DW
2
DNA
5
Restriction enzyme (BamH I)
1
Restriction enzyme (Hind III)
1
Total
10
37℃ heating block에서 1~3시간 incubation한다.
Agarose gel electrophoresis
<Materials>
1% agarose gel, TAE buffer, DNA marker, 6X DNA loading dye, power supply, 전기영동기
1) Restiction enzyme 처리한 vector(pRSET A), insert(Lac Z)에 6x dye (final 1X)를 섞는다.
(6x agarose gel loading dye : bromophenol blue, glycerol이 포함됨)
2) 전기영동기에 1% agarose gel을 올려놓고 TAE buffer를 gel 이 잠길 정도로 채운다.
3) 1% agarose gel의 well에 Sample과 Marker를 loading한다.
4) electrophoresis(100 V, 25 min )를 진행한다.