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2010 식품 가공학 특론
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4-α-Glucanotransferase에 의해
백설기의 변형된 전분에 대한 구조적 특성
충북대학교 식품공학과
한덕만
목차
선정 논문과 선정 이유
효소 특성
연구 목적
실험 방법
결과
결론
선정 논문
선정 이유
 식품산업에서 떡은 제대로 가공식품으로 나오지 않아 그것에 관해 궁금하고 해결방
안을 생각해 보기 위해 이 논문을 선택
 떡는 산업적으로 생산하는데 어려움이 있음
 이유 : 높은 전분 노화율로 인해 유통기한이 매우 짧아짐. 저장성이 떨어짐
 전분의 노화과정을 늦추기 위한 많은 연구가 시도됨
 이러한 연구를 통해 전분의 노화를 지연시키기 위해서 그리고 품질 향상을 위해 유화
과정, 올리고당 생성, 다당체 생성에 관여하는 많은 효소들이 개발됨 (Kweon and
others 1994; Christophersen and others 1998; Lee and others 2002; Gujral
and others 2003)
 전분 연구에 이용된 효소는 직접적으로 전분 구조를 변형시킴으로써, 전분의 노화를
방지시키며 유동적 특성(물질의 특성을 변화시킴)을 향상시킴
 다양한 효소를 이용하여 변형된 전분의 기능성 특성은 식품산업에서 커다란 주목을
받고 있음
4-α-glucanotransferase
 식물의 불균화 반응(당을 움직여 구조를 변경-가수분해 또는 재결합 반응을 일으킴)
에 이용되는 효소
 Glucose의 α-1,4 결합을 가수분해하거나 malto-oligosaccharide의 donor(당을 내
줌) 분자가 새로운 α-1,4 결합을 통해 acceptor(당을 받음)에 결합(tranfer함)하는
반응을 함
 TSαGTase는 Thermus scotoductus 에서 유래함
 TSαGTase를 감자 전분에 반응하면 크기가 작은 올리고당의 생성은 없으며
amylopectin의 side chain(가지)의 재결합이 상당히 많이 이루어짐 (Park and
others 2007)
 즉, amylose가 amylopectin의 짧은 side chain쪽으로 결합하여 amylose의 함량이
낮아지게 만드는 효소임
상동성 비교
Thermus scotoductus
Thermus aquaticus
Thermus brockianus
Meiothermus silvanus
Deinococcus geothermalis
4-α-glucanotransferase의 구조
PDB ID : 1LWH (dimer)
Thermotoga maritima
Anna Roujeinikova et al., J. Mol. Biol. (2002) 321, 149–162
연구 목적
 TSαGTase 처리를 통해 백설기에서 쌀 전분의 구조와 질감(texture), 노화율에 미치
는 영향을 알아보고자 함
 이를 통해 백설기의 유통 및 저장 기한을 연장시키는 연구를 하고자 함
 이번 연구는 식품계(식품의 반응계)에서 품질과 저장 기한의 향상을 위해 4-αglucanotransferase를 이용한 선도적인 시도임
TSαGTase의 cloning과 효소 정제
 Thermus scotoductus strain (ATCC 27978) : American Type Culture
Collection (ATCC)에서 구입
 유전자를 cloning하고 형질 전환함(Park and others 2007)
 E. coli MC1061을 host로 이용
 사용 plasmid는 pGNX4와 pUC119를 cloning에 이용
 TSαGTase의 정제는 Ni-NTA affinity chromatography를 이용
 재조합 대장균 1L 를 배양
 4℃ 원심분리에서 10000xg, 10분간 원심 분리하여 세포만 획득
 Cell pellet은 100ml lysis buffer에 다시 풀어줌
TSαGTase의 cloning과 효소 정제
 Sonicator를 이용하여 얼음에서 셀을 파쇄
 Crude한 세포 추출액을 다시 원심분리(4℃, 10000xg, 20분)
 2ml의 Ni-NTA resin이 packing된 column에서 세포 추출액 2ml을 loading
 Washing buffer로 column을 resin과 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 wash
함
 Elution buffer를 이용하여 TSαGTase를 elution함
 Elution 한 효소는 SDS-PAGE로 정제 확인
 최적 buffer인 50mM Tris-HCl (pH 7.5)로 투석
 최적 반응 조건 : 75℃, pH 7.5로 반응
TSαGTase의 활성 측정
 TSαGTase의 활성은 amylose가 전환되는 것을 요오드 용액에 반응하여 측정
(Liebl and others 1992)
 반응 조건 : 기질인 0.2%의 amylose 250ul와 1%의 maltose 50ul에 최적 buffer
600ul을 섞고, 효소 100ul을 넣은 후 70℃에서 10분간 반응
 Total reaction volume 1ml =0.2% amylase 250ul+1% maltose 50ul+buffer
600ul+enzyme 100ul
 10분간 끓여줌으로써 반응 정지
 1ml의 요오드 용액을 넣은 후, spectrophotometer를 이용해 620nm에서 흡광도를
측정
 TSαGTase unit의 정의 : 분당 amylose가 0.5mg/ml로 가수분해되는 효소의 양
 단백질 농도는 Bradford방법을 이용, stanadard는 BSA(bovine serum albumin) 사
용
백설기 제조 후 쌀 전분 분리
 쌀가루는 삼립 식품에서 얻음
 각각의 재료(쌀가루 100 g, 설탕 10g, 소금 1g, 물 20ml)를 섞음
 재료에 TSαGTase를 넣고 75℃에서 3시간 방치
 효소가 들어간 재료는 플라스틱 틀에 넣고 30분간 찜
 30분간 찐 후, 30분간 식힘
 효소가 없는 백설기도 같은 방법으로 제조하고 이것을 control로 함
 백설기 1g을 90%의 dimethyl sulfoxide에 1%가 되도록 넣어줌
 1시간 가열 후, 약 16시간(overnight) 동안 교반(stirring)
 Sample의 6배 volume의 ethanol을 넣어 다음 잘 섞어줌
 원심분리 후, 상등액을 제거 후, 침전물은 50℃에서 건조시킴 (분말로 만듦)
Amylose 함량 분석
 백설기 속에 있는 쌀 전분의 amylose함량은 요오드 측정법을 이용하여 색의 변화를
측정(juliano 1971)
 Sample 100mg을 정확히 취한 후, 50ml의 삼각 플라스크에 넣음
 95% ethanol 1ml과 1N NaOH를 9ml을 넣어줌
 끓는 물에 10분간 가열함
 실온에서 식힌 후, 100ml의 메스 플라스크에 옮김
 이 플라스크에 전체 volume이 100ml이 되도록 증류수를 첨가함
 전분 용액 5ml(위에서 만든 전분 용액)을 새로운 100ml의 메스 플라스크에 넣고,
1N의 acetic acid 1ml과 요오드 용액(요오드 0.2g과 potassium iodide 2.0g을 넣어
액상의 용액으로 만듦) 2ml을 첨가
 100ml의 부피가 되도록 증류수를 채워 희석한 다음, 섞어주고 20분간 방치
 Spectrophotometer를 이용해 620nm에서 흡광도 측정
쌀 전분의 분자량 측정 방법
 백설기 속의 쌀 전분의 분자량은 SEC-MALLS-RI system(레이저 빛이 샘플에 쪼여
준 후, 산란되어 생기는 다양한 각을 측정하여 size를 확인)을 이용해 분석함
 SUGAR KS-804와 KS-806 column 두 개를 일렬로 연결한 후 실온에서 측정
 이동상(0.02%의 NaN3가 들어 있는0.15M NaNO3용액)은 0.4ml/min의 유속으로 흘
려줌
 건조시켜 분말이 된 sample은 이동상과 같은 용액에 녹인 후, 가압멸균(autoclave;
121℃, 20min)함
 가압 멸균된 sample을 주사기용 filter(pore size 5-um)로 여과 후 SEC-MALLSRI system에 주입
 Sample의 평균 분자량은 ASTRA V4.90.07(software 이름) program으로 계산
HPAEC(Bio-LC) 분석
 효소처리된 전분의 side chain의 분포를 알아보기 위해 isoamylase를 이용해 가지
를 분해 시킨 후 분리함
 Isoamylase의 반응 조건 : 60℃에서 60시간 반응, 25mM NAOAC buffer(sodium
acetate buffer, pH 4.3)
 5분간 끓여 줘 반응을 정지하고 amylopectin 가지의 다양한 결합길이는 Bio-LC를
이용해 분석
 Bio-LC에 사용한 column은 CarboPac PA-1 column이고 이 column을 통과하여
각각의 가지로 결합된 길이가 다양한 올리고당이 분리됨
 백설기 속에 있는 malto-oligosaccharide의 구성 분석은 백설기 1g에 100ml의 증
류수를 넣고 1시간 가열
 주사기용 filter(pore size 5-um)로 여과 후, isoamylase 처리를 하지 않고 다른 조
건은 동일하게 한 다음 Bio-LC로 분석
Differential scanning calorimetry(열량 측정기)
 백설기 sample을 4℃에서 24시간 방치 후 전분 노화의 정도를 실험
 백설기 sample의 노화는 differential scanning calorimetry(DSC)를 이용해 측정
 DSC는 indium(156.6℃, 28.591J/g)과 tin(232.2℃, 60.62J/g)을 이용해 0점 조절을
하고 reference로 증류수를 사용
 물과 고형물인 백설기가 수분 함량이 1:1 되도록 만든 다음, 10mg으로 무게를 잰 백
설기 sample은 알루미늄 팬에 밀봉하여 넣고 5℃/min씩 증가하는 속도로 20℃에서
120℃까지 가열
 노화 정도는 DSC 분석으로 나타난 40℃에서 80℃사이의 흡열 peak의 면적을 계산
한 엔탈피로 표현함
백설기의 질감(texture) 분석
 Texture profile analysis (TPA)는 texture 분석기를 이용해 실온에서 백설기
sample 6g을 측정
 2-cycle compression은 시간당 가해지는 힘을 비교하는 것으로 지름 50mm로 된
원형의 플런저(피스톤 같은 것을 밀어내도록 되어 있는 기기)로써 texture 분석은 이
플런저를 가지고 50%의 압력을 가해 2mm/s의 속도로 실험
 TPA의 수치값은 Munoz(1986)에 의해 정의 내려지고, Bourne(1982)가 기술함
백설기 속의 amylose와 malto-oligosaccharide함량 분석결과

표1에서 보면, TSαGTase 처리는 16.6%에서 12.7%로 백설기 속의 amylose의 함량을 낮춤

낮은 amylase 함량을 갖고 있는 백설기는 texture가 좋아지고 노화가 늦어짐

전분의 노화는 효소처리에 의해 amylose 결합이 효소반응 중 일어나는 재결합 반응에 영향을
받아 amylose 함량이 낮아지고 이러한 전분은 저온에서 저장하는 동안 전분의 노화가 천천히
진행된다고 보고됨 (Auh and others 2006)

효소 처리된 백설기의 malto-oligosaccharide의 함량은 control과 비교했을 때 함량이 더 높
음
백설기 속의 TSαGTase 처리한 쌀 전분의 분자량 분석
백설기 속의 쌀 전분의 가지 결합의 분포
백설기 속의 쌀 전분의 가지 결합의 분포
백설기의 질감 분석

TSαGTase처리한 백설기의 hardness(견고성)은 4℃에서 24시간 방치한 후, 측정해 보니
control과 비교했을 때 약간 증가함 (control의 증가 폭이 더 큼)

cohesiveness(응집력)의 control과 TSαGTase처리한 sample과 유사한 결과가 나타남

Adhesiveness(접착성)의 변화는 확실히 차이가 있음

control은 거의 접착성이 사라진 반면에 효소 처리한 sample은 유지가 됨

이러한 결론을 종합해 보면, 전분의 노화 정도는 효소에 의한 구조 변형으로 확실히 감소 시킴
을 알 수 있음
백설기의 노화
백설기의 노화
 저장기간 동안 control의 백설기가 TSαGTase처리한 백설기보다 노화율이 더 높음
 4℃에서 24시간 저장한 후, 효소 처리한 sample은 control (1.4mJ/mg)보다 더 낮은
값(0.4mJ/mg)을 나타냄
 TSαGTase의 처리가 백설기에서 전분의 노화를 효과적으로 저해함을 보여줌
 전분을 가수분해하는 효소가 전분의 노화를 늦추는 것은 필수적인 mechanism이지
만 아직 완전히 밝혀지지 않음
 종종 이러한 효소가 amylopectin 분자의 구조를 변형시키는 것은 저장기간 동안 분
자구조가 단단해지는 현상이 증가되지 않도록 분자가 재결합하기 때문인 것이 확실
하다는 보고가 있음(Gerrard 1997; Gujral and others 2003; Hug-Iten and others
2003)
저자의 결론
 이 번 연 구 로 TS α GTase 의 처 리 로 인 해 Amylose 의 함 량 이 감 소 되 는 것 과
Amylopectin이 재결합하는 것, malto-oligosaccharide가 형성되는 것이 백설기에
서 전분의 노화를 지연시키는 효과가 있음을 기정 사실화 함
 TSαGTase 처리는 백설기 속 쌀 전분의 노화를 저해시키는 amylose 함량의 변화와
전분 분자량의 감소, amylopectin의 가지의 결합 길이의 변화를 발생시킴
 결과적으로 분명한 것은 TSαGTase와 같은 효소를 쌀 전분에 처리하는 것이 백설기
의 산업적 생산에 성공적으로 적용할 수 있음을 확인
 본 연구의 실험적 증거가 malto-oligosaccharide, amylose, amylopectin과 같은
각각의 탄수화물의 구성 분이 어떻게 노화를 지연시키데 효과가 있는지 확인하는 것
에는 부족함
 전분의 노화는 쌀 전분의 산업적 이용에 가장 주된 문제가 되기 때문에, 백설기의 산
업적 생산공정의 향상을 위해서는 쌀 전분 노화 방지에 대한 분자 수준의 메커니즘의
이해와 연구가 필요함
발표자의 결론
 전분 구조 변화가 전분의 물리화학적 특성에 영향을 미치며, 산업적인 이용에서 중요
한 요소로 작용할 수 있다고 생각됨
 이러한 효소 공정에 의한 가공은 선택적이고 예상 가능한 산물이 나오기 때문에 물리
화학적 공정 중 나타날 수 있는 예상치 못한 결과물에 대한 단점을 극복할 수 있음
 Thermus scotoductus 에서 유래한 4-α-glucanotransferase를 식품 산업에 적용
할 수 있는지 제시되지 않았음
 만약 유전자 변형 효소를 식품에 적용이 불가능 한다고 해도 우선적으로는 이러한 효
소 공정을 개발한 후, GRAS 미생물에서 유래한 효소를 이용하면 될 것으로 생각됨
 요즘은 다국적기업에서 유전자변형 효소의 사용 승인을 얻어 이용하고 있으므로 필
요하다면 (경제적 부담이 크지만) 승인을 얻으면 될 것으로 판단됨
참고문헌
 Kwang Yeon Lee et al. (2008). Rheological and gelation properties of rice starch
modified
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4-α-glucanotransferase.
International
Journal
of
Biological
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 N.-S. SEO et al. (2007). Structural Characterization of Rice Starch in Rice Cake
Modified by Thermus scotoductus 4-α-Glucanotransferase (TSαGTase) JOURNAL
OF FOOD SCIENCE. Vol. 72, 331-336
 CHANG-KYU LEE et al. (2008). Enzymatic Synthesis and Properties of Highly
Branched Rice Starch Amylose and Amylopectin Cluster. J. Agric. Food Chem. 56,
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 Anna Roujeinikova et al. (2002). Crystal Structure of Thermotoga maritima 4-aGlucanotransferase and its Acarbose Complex: Implications for Substrate pecificity
and Catalysis J. Mol. Biol. 321, 149–162