Transcript 6주차_Plasmid mini prep. 실험방법

6주차
생화학 및 분자생물학실험
Plasmid mini prep
DNA electrophoresis
Transformation(Expression)
Content
1.
Purpose
2.
Introduction & Theory
•
Plasmid mini prep
•
Agarose gel electrophoresis
•
DNA quantitation
•
Transformation(Expression)
3.
Materials & Methods
4.
Results
Purpose _ Plasmid mini prep.

Plasmid mini prep kit를 이용해서 E.coli 로부터 DNA를 분리하여 정
량 해보고 Agarose gel electrophoresis를 통해 확인한다.

얻어진 DNA와 Protein Expression용 Competent cell을 이용하여
Transformation한다.
Materials & Method
1.
2.
Plasmid mini prep.
Agarose gel electrophoresis
Plasmid mini prep.
1.
①
Cell pre-inoculation
지난 시간에 Transformation을 통해 얻은 colony 1개를 Amp이 들어
간 5 ml LB media에 접종한다.
②
접종 후 37ºC incubator에서 16~18시간 incubation한다.
③
Incubation이 끝난 후 Plasmid mini prep kit를 사용하여 Plasmid
DNA를 추출한다.
Plasmid mini prep.
2.
①
②
③
④
⑤
⑥
⑦
⑧
⑨
LaboPass Plasmid mini prep Kit
Cell culture 5ml을 Centrifuge하여 Cell Down시킨다. 그 후 Pellet만 남기고
Supernatant는 제거한다.
Pellet에 Buffer S1 250μl를 섞어 Pellet을 풀어준다. (Vortexing)
Buffer S2 250μl를 섞어준다. (Inverting 4~5회)
Buffer S3 350μl를 섞어준다. (Inverting 4~5회)
10분 동안 Centrifuge한다.
Centrifuge 후, Supernatant을 Spin column으로 옮긴다. 그리고 30초간 Centrifuge
를 해준다.
Wash Buffer 700μl를 섞고 30초간 Centrifuge를 해준다.
추가로 Centrifuge를 1분간 더 해준다. (건조)
Spin column에 dH2O 50μl를 첨가한다. 그리고 1분간 Centrifuge를 해준다.
Agarose gel electrophoresis
& Quantitation
3.
Agarose gel Electrophoresis
Plasmid mini prep 후 얻어진 Plasmid DNA를 전기영동으
로 확인해본다.
4.
DNA quantitation
① Spectrophotometer를 OD260으로 setting.
② 3’DW 200μl 로 blank를 잡는다.
③ 3’DW 198μl + DNA 2μl를 넣어 만든 sample의 흡광도
를 측정하여 DNA의 농도를 확인한다.
Results

Agarose gel 사진을 통해 Plasmid mini prep 이 잘 되었는지를 확인

Plasmid의 3가지 형태가 관찰 되는지 확인

Colony의 확인을 통해 Transformation이 잘 되었는지를 확인