Transcript 조류생물학

Gel extraction
Gel extraction이란?
# Molecular biology에서 gel extraction은 agarose gel electrophoresis에서 얻은
DNA의 fragment를 분리하는 기술이다. 전기영동 되어진 gel에서 원하는 밴드만
cutting하고 이렇게 cutting되어진 gel에서 DNA만을 회수 한다. Elution 되어진 DNA
중 일부는 다시 gel electrophoresis해서 제대로 회수되었는지를 확인하는데 쓰인다.
# QIAquick Gel Extraction Kit는 TAE, TBE buffer agarose gel에서 70bp~10kb의
DNA를 추출, 정제하기에 적합하다. 특히, enzymatic reaction 으로부터 DNA를
clean-up 하거나 또는 gel extration을 할 목적으로 사용한다.
(http://www.youtube.com/watch?v=NfD0jSY5K7g&feature=youtu.be)
실험: Gel extraction
(1) 주 재료
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Gel extraction kit (Cat.No. 28704)
① Buffer QC (Solubilization buffer)
② Buffer PE (Wash buffer, 실험전에 에탄올 첨가할 것)
③ Buffer EB
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1% agarose gel
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지난 시간 각각 BamH І , EcoRІ, Hind Ⅲ 로 자른 pcDNA 6B EGFP-EcR(size: 7,724 bp)
의 플라즈미드 백터
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50°C 항온수조
(2)재료 및 장비
- 아가로스
- 5x TBE buffer
- Ethidium bromide Stock 10mg/ml
- 100ml 삼각플라스크
- 전자레인지(방열장갑 착용)
- 파이펫, tip
- Gel loading buffer(6X)
- DNA Size marker
- 전기영동장치
- UV transiluminator
(2) 실험방법
1. 미리 전기영동 된 1% agarose gel로부터 DNA조각을 깨끗하고 날카로운 메스로 절개한
다.
Notice! 여분의 agarose를 제거하여 gel 조각의 크기를 최소화 할 것
2. 투명한 tube에 넣은 gel 조각의 무게를 측정한다. 이때 gel volume에 3배의 buffer QG(오
렌지색)를 첨가한다. (ex) gel 100 mg당 buffer QG 300 ul
Notice! QIAquick column당 최대 gel 조각의 최대양은 400 mg이다. 400 mg을 초과하는
gel 조각에 대해서는 다른 QIAquick column을 사용하도록 한다.
3. 50℃, 10 min incubation (gel 조각이 완전히 녹을 때 까지). Gel 용해를 촉진시키기 위해서
incubation 하는 동안 2~3분 마다 tube를 vortexing하여 혼합한다.
Notice! Agarose를 완전히 용해한다. 용액의 색이 노란색으로 변하는지 체크할 것! 만약 오
렌지색이라면 10ul의 3 M sodium acetate (pH 5)를 첨가하여 혼합할 것
Notice! QIAquick membrane에 DNA의 흡착되기 위해서는 pH 7.5 이하의 조건이 필요한
데, buffer QG는 pH 지시약을 함유하여 pH 7.5 이하에서는 yellow를 띄고 pH 7.5 이상에
서는 orange or violet 색을 띈다. 이로써 DNA binding을 위한 최적 pH의 결정을 할 수 있
다.
4. 1 gel volume의 isopropanol을 sample에 첨가하고 혼합한다
이 처리는 <500 bp과 >4 kb DNA 조각의 수득률을 증가시킨다. 반대로, 500 bp 와 4 kb
사이의 DNA 조각은 isopropanol의 첨가가 수득률 증가에 효과가 없다.
5. 제공된 2 ml collection tube에 QIAquick spin column을 장착하고 시료를 column 에 부
은 후 1min, 13000rpm으로 centrifuge한다.
Notice! Column의 최대 가용량은 800 ul 이다. 800 ul 이상의 sample은 과정을 반복하여
실행한다.
6. 여과액을 버리고 QIAquick column을 다시 같은 collection tube에 위치시킨다.
7. 혹시라도 남아있는 gel 성분들을 완전히 제거하기 위해서 buffer QG 0.5 ml를 QIAquick
column에 넣고 1 min, 13000rpm으로 centrifuge 한다.
8. 세척을 위해서 buffer PE 0.75 ml를 QIAquick column에 첨가하여 1 min, 13000rpm으
로 centrifuge 한다
Notice! blunt-end ligation이나 direct sequencing 같은 염분 민감성(salt-sensitive)반
응의 목적을 위해 사용하는 DNA는 column을 centrifuge 하기 전 buffer PE를 첨가한 후
에 2-5분 동안 새워둔다
9. 여과액을 버리고 QIAquick column을 1분 동안 13,000 rpm centrifuge 한다
Notice! 이 단계에서 추가적인 centrifuge를 하기 전에 여과액을 버리지 않는 한 buffer PE
에서 남은 ethanol은 여전히 제거되지 않는다.
10. QIAquick column을 새로운 1.5 microcentrifuge tube에 꽂는다.
11. DNA를 녹여서 분리하기 위하여 buffer EB 30 ul (10 mM Tris-Cl, pH8.5) 또는 water
(pH 7.0-8.5)를 QIAquick membrane의 중앙에 첨가한 뒤 column을 1분 동안 반응시킨
후 13000rpm으로 centrifuge 한다.
12. 정제된 DNA는 DNA 5 volume당 1 volume의 6X loading Dye를 첨가하여 loading 한
다.
13. 1% agarose gel 에서 100V로 25분간 전기영동을 한다.