Transcript 조류생물학
Agarose Gel Electrophoresis Gel Electrophoresis # 겔 전기영동은 전류를 흘려주어서 전하를 가진 입자가 겔 내부에서 이동하여 분리되도록 하는 기술이다. 아가로스 겔은 해상도는 낮지만 200bp에서 50kb까지 크기에 따라 이동 하는 속도차이로 분리할 수 있다. 즉, 작은 분자는 큰 분자에 비해 빠른 속도로 이동하기 때문에 결과적으로 서로 다른 크기의 분자들은 겔 상에서 서로 다른 위치에서 띠 모양을 나타내게 된다. 각각의 띠를 이루고 있는 분자들의 크기는 이미 크기를 알고 있는 분자들 을 나란하게 전기영동하여 겔 상에 나타난 띠의 상대적인 위치를 비교함으로써 그 크기 를 측정할 수 있다. # 전기영동은 이와 같은 원리를 이용하여 분자량 결정을 비롯하여 순도결정, 각 성분의 정 량, 정제 등에 이용되고 있으며, 단백질이나 핵산의 주된 분리분석법이 되고 있다. # DNA나 RNA의 경우 주로 아가로즈(agarose)를 사용하고, 단백질의 경우 폴리아크릴아 마이드(polyacrylamide) 등을 굳혀서 겔을 만든다. 졸-겔 전이 [ sol-gel transition ] # 졸과 겔이 온도, 압력, pH 등 외적 조건의 변화에 의해 한편의 상태에서 다른 편의 상태로 옮기는 것을 졸-겔 전이라고 한다. 계란을 삶는 과정은 졸→겔 전이의 가장 잘 알려져 있는 예이며 비가역적이다. 한천, carageenan, 젤라틴, methylcellulose 등은 열에 의한 가역성 반응이다. # 한천이란 우뭇가사리를 건조한 것으로 한천의 구조는 아가로스와 아가로 펙틴으로 불리는 다당류로 겔을 만드는 재료인 아가로스 이 한천을 정제하여 만든 것이다. 아가로스 농도에 따른 DNA 분리범위 # 아가로스 겔의 밀도는 아가로스의 농도(%)에 따라 결정된다. 아가로스 농도(%) DNA 분리 범위(kb) 0.3 5-60 0.6 1-20 0.8 0.8-10 1.0 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 DNA ladder http://www.axygenbio.com/ # Size 확인을 위해 흔히 marker를 사용하는데 size marker는 보통 파지 DNA를 제한효소로 잘라 사용한다. Features: ◦Ready-to-use ◦Includes bromphenol blue for ease of use ◦Stable at room temperature 실험: 아가로스 겔 전기영동 (1) 재료 및 장비 # EtBr(분자식: C21H20BrN3, - 아가로스 (agarose) 분자량: 394.33)은 DNA의 - 5x TAE buffer or TBE buffer 검출에 사용하는 색소다. 2 - Ethidium bromide Stock 10mg/ml --> 최종농도 0.5 μg/ml 중 가닥 DNA의 GC결합 아가로스 겔 25ml당 EtBr stock은 2 μl 넣으면 적당하다. 드시 보호 장갑(poly-glove) 끼고 할 것! - Gel loading buffer(6X) 사이에 정량적으로 끼어 반 들어가지만 외가닥 DNA 또는 RNA에서도 약하게 결합한다. 자외선에 의해 - DNA Size marker 주황색이 강한 형광을 보 - 100ml 삼각플라스크 이기 때문에 전기 영동 후 - 전자레인지,방열장갑 착용 or 목장갑 DNA분자의 검출에 자주 - 옐로우 파이펫 (2-20 μl), yellow tip, 파라필름(parafilm) 사용한다. 발암성 물질이 - 증류수 1리터 - Gel tray - 전기영동장치 - UV transiluminator 기 때문에 사용할 때에는 반드시 장갑을 사용해야 한다. (2) 실험방법 아가로스 겔 만들기 ① 0.8% 아가로스 겔을 만들기 위해 100ml 삼각플라스크에 25ml 1XTAE buffer와 0.2g 아 가로스 분말을 섞는다. ② 뭉친 분말이 없는 것을 육안으로 확인한 후 랩으로 덮고 증기가 빠지도록 구멍을 뚫어준 다. ③ 전자레인지를 사용해 1-3분 정도 지나 아가로스 입자가 완전히 녹으면 실온에 꺼내 기포 가 생기지 않게 부드럽게 흔들어 섞는다. Notice! 화상의 위험이 있으니 장갑 착용할 것 ④ 상온에서 50-60℃까지 식힌 다음 EtBr을 첨가한다. Notice! EtBr에 사용했던 tip은 따로 수거해서 폐기한다. ⑤ Gel tray에 겔을 붓고 comb을 꼽은 후 최소 실온에서 30분간 gel을 굳힌다. ⑥ 겔이 굳은 후 바로 사용하지 않을 겔은 빛이 차단되는 용기에 0.5XTAE buffer를 채운 후 완전히 담궈서 보관한다. ⑦ 겔의 홈(well)부분이 전기 영동 tank에 “–” 극 쪽에 위치하도록(DNA는 인산기가 음전하 를 띠기 때문에 –에서 +로 이동한다.) 넣고 0.5X TAE를 겔 위로 3mm까지 차도록 붓는다. 시료준비 및 전기영동 ⑧ loading buffer 1 μL에 sample 5 μL (elution buffer로 희석, 1:4)를 섞고 well(작은 well은 20 μL, 큰 well은 60 μL 까지 가능하다)에 조심스럽게 loading하고 여분의 well 에 DNA size marker 3 μL loading 한다. ⑨ 전원을 연결하고[black(-), red(+)] 전기영동을 약 30분간 100V로 걸어준다. ⑩ bromophenol blue가 겔의 2/3 정도에 오면 멈춘다. ⑪ UV transilluminator 관찰 pcDNA 6B 5130 bp pcDNA 6B EGFP-EcR 7724 bp EGFP-EcR # pcDNA 6B size: 5130bp # pcDNA 6B EGFP-EcR size: 7724bp