Transcript 조류생물학
PCR PCR이란? # 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 DNA 또는 RNA의 특정영역을 시험관 내에 대량으로 증폭하는 획기적인 분자 생물학적 기술이다. # 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 짧 으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반 에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다. # 현재는 PCR법도 더욱 다양한 응용 기술이 개발되었다. 이러한 응용 기술로는 역전사효소 (reverse transcriptase)를 이용해서 RNA를 직접 증폭시키는 RT-PCR이 대표적이며, 이 외에도 형광 물질을 붙여서 PCR을 진행하며 관측되는 정량적인 변화를 이용하여 원래 DNA나 RNA의 양을 정확히 측정하는 정량적 PCR 또는 실시간 PCR(Real time PCR), 한 번에 수많은 PCR을 동시에 시행하는 대용량 PCR 같은 여러 방법이 있다. PCR 원리 # PCR의 원리는 극히 단순하다. http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU 반응조건 # 증폭될 DNA와 프라이머에 의존하여 반응 온도와 시간이 결정되며, 가장 중요한 것은 프라 이머 설계와 결합온도를 결정하는 것이다. (1) DNA 변성(Denaturation) 일반적으로 두 가닥 DNA를 94℃에서 15~30초간 처리하여 각각 한가닥 DNA로 분리시킨다. 너무 온도를 높이거나 처리시간을 지나치게 늘리면 내열성 DNA polymerase라 해도 활성 을 잃게되므로 주의가 필요하다. 첫 번째 주기(cycle)에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킨다. (2) Primer의 Annealing 열처리로 한 가닥으로 변성한 DNA와 primer를 공존시킨 후 온도를 낮추면 2종류의 primer 는 각각 상보적인 한가닥 주형 DNA에 annealing한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시 간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 annealing한다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람 직하다. Annealing 온도를 높이면 primer-주형 DNA의 mismatch가 감소되어 반응 특이성 이 높아진다. 그러나 혼합 primer 또는 mismatch를 갖는 primer를 사용할 경우는 37~45℃ 로 annealing 온도를 낮출 필요가 있다. 이 단계에서 primer의 5'→3'방향으로 DNA의 합성 이 시작된다. (3) 신장반응(Extension) 4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서, DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신 장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따 라 좌우되지만 일반적으로는 Thermus aquaticus(Taq) polymerase를 사용할 경우 72℃에서30초~10분간(증폭크기 약 10 kbp)처리한다. Taq polymerase에 의한 DNA 합성속도(약 60 nucleotides/sec, 70℃)를 고려하여 시간을 설정한다. PCR 산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle에는 약 10 분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋다. (4) Cycle 수 PCR의 경우 n회의 cycle로 표적배열은 2n배가 되지만 실제로는 이보다 낮다. 효율이 저 하되는 이유는 ① DNA polymerase의 실활 및 증폭단편(주형DNA)의 증가로 인한 효소 분자/주형비의 부족과 ② 증폭단편간의 annealing되는 속도가 빨라져서 primer의 anneal과 경합하기 때문이다. 따라서 반응 cycle 수를 불필요하게 증가시키는 것은 바람 직하지 않다. 보통 20-30회의 반응을 시킨다. 프라이머 설계 # PCR 반응에서 가장 중요한 일은 원하는 유전자에 정확하고도 특이적으로 결합하는 프라이 머를 선정하는 일이다. 프라이머는 대개 15-mer 이상의 길이로 목적하는 유전자만 특이적 으로 결합하는 염기서열이어야만 한다. 프라이머의 길이가 길어질수록 비특이적인 결합을 막을 수 있기 때문에 24-30mer로 길게 합성하기도 한다. # 프라이머 설계시 유의 사항 - 길이는 20-30mer - G+C%가 50-60%로 구성하고 퓨린과 피리미딘 염기의 연속적인 배열을 피한다. - 한 쌍의 프라이머에 부분적인 상보 염기서열이 없어야 한다. 프라이머끼리 결합할 수 있기 때문이다. - 3’ 말단에 티민 오지 않도록 한다. 티민은 자신과 상보적인 뉴클레오티드를 감별하는 능력이 부족하여 mismatch하는 경우가 많다. - 프라이머 3’말단에 G와 C가 3개 이상 연속적으로 오지 않도록 한다. - 두 프라이머의 Tm값은 가능한 동일하게 한다. 반응액의 조성 (1) 내열성 DNA Polymerase 수 종류의 내열성 DNA polymerase가 시판되고 있는데 반응에 사용하는 완충액의 조성이 다를 수 있으므로 주의가 필요하다. TaKaRa Taq을 사용할 때 DNA합성의 최적 온도는 대개 70~80℃ 이고 그 합성속도는 60nucleotides 이상/초이다. 활성 반감기는 92.5℃에서 130분 이 상, 95℃에서 약 40분, 97.5℃에서 약 10분간이다. 효소량이 과다일 경우 잘못 결합된 프라이머 로부터 DNA가닥이 합성된다. (2) Mg2+ 농도 일반적으로 PCR반응에서는 1.5~2.5 mM의 Mg2+ 농도가 필요하다. Mg2+ 농도는 PCR을 실 행할 때 다음의 사항에 관여하고 있는 것으로 여겨진다. ① 효소활성, ②primer의 annealing, ③ 합성된 DNA의 충실성, ④primer-dimer의 형성 등이다. 킬레이트제(예를 들면 EDTA)는 반응 액 속의 Mg2+ 농도에 영향을 미치므로 주형으로 사용하는 DNA 용액에서 turn over하는 것에 주의할 필요가 있다. 또한 유효한 Mg2+ 농도는 dNTP 농도와도 관계가 있으므로 어느 실험에 서나 최적 Mg2+ 농도를 결정하고자 할 경우 항상 dNTP 농도를 고려해야 한다. 일반 적으로 Mg2+ 농도가 높아지면 DNA 합성의 정확도에 영향을 미칠 뿐만 아니라 두 가닥 DNA 변성이 어려워지고, Taq polymerase는 10 mM MgCl2에 의해 40~50%의 저해를 받으므로 MgCl2를 과잉 첨가하는 것은 바람직하지 않다. (3) dNTP PCR의 효율, 특이성면에서 보면 20~200 μM에서 양호한 결과를 얻을 수 있다. DNA polymerase가 잘못된 dNTP를 사용하는 mismatch 현상은 dNTP 농도에 강하게 의존한다. dNTP 농도를 낮추는 쪽이 PCR 특이성과 정확도가 높아지므로 dNTP 농도를 낮추면 misprimming이 감소하여 PCR의 정확도가 높아진다. 4가지 뉴클레오티드의 농도가 동일해야 만 정확한 염기가 결합한다. (4) 주형 DNA, RNA PCR법은 여러 가지 형태의 DNA와 RNA를 주형으로 하여 사용할 수 있다. 가장 간편한 DNA 조제법으로는 소수의 조직배양 세포를 증류수 속에서 가용화하여 PCR에 사용하는 방법이다. 또한 사람의 한 가닥의 머리털로부터 PCR 증폭하는 다형분석, 포르말린으로 고정한 파라핀 조직으로 PCR도 실시하고 있다. 혈액에서 주형 DNA를 조제할 때는 헤모글로빈이나 기타 미 지물질이 PCR 반응을 저해하는 점에 주의가 필요하다. 최근 법의학 분석에서 혈액 또는 머리 털을 마이크로파 처리하여 그대로 PCR에 이용한다는 보고도 있다. 주형DNA 양으로는 1단계 PCR에서 105~106 분자에 상당하는 양이 있으면 양호한 결과를 얻을 수 있고 3X105개의 분 자는 human genome DNA에서는 1㎍, 효모 DNA에서는 10ng, 대장균 DNA에서는 1ng에 상 (5) 반응첨가물 많은 염기배열을 복수의 primer set를 사용하여 동시에 1개의 반응 tube 내에서 PCR 증폭하 는 방법을 다중 PCR(multiplex PCR)이라 한다. 근육병의 원인인 디스트로핀 유전자의 결실 변이를 18종류의 primer를 사용하여 검출할 수 있다. 일반적으로 multiplex PCR반응액에는 10%(v/v) dimethylsulfoxide(DMSO)를 함유한다. 유기용매는 보통 Taq polymerase에는 적 합하지 않지만 multiplex PCR에는 필수적이다. Taq polymerase의 저해물질로서 SDS(<0.01%)가 알려졌으나, 비이온 계면활성제 Tween-20이나 nonidet-P40의 첨가로 그 저해를 억제할 수 있다. 또한 DMSO(2~5%),PEG6000(5~15%), 글리세롤(5~20%), 포름아 마이드(5%)나 BSA(bovine serum albumine)첨가로 반응 촉진효과를 얻을 수도 있다. 실험:PCR condition test(농도) (1) 재료 및 장비 - PCR machine - DNA template - Primer(forward, reverse) - DNase free dH2O - PCR premix - 1.5% agarose gel - Marker - 전기 영동기 - 1.5ml tube - 파이펫 (2) 실험방법 (http://www.youtube.com/watch?v=buxwFXEpdTU&feature=related) 1. Template 농도( 0.5ng/µl) 2. Primer 농도: 25pmol/µl 3. PCR mixture 제조 (negative control 포함) - PCR premix (2X) 10µl - Template 1µl - Primer(F,R) 0.5µl, 0.5µl - dH2O 8µl - Total 20µl 4. PCR cycle - Step #1 95 °C 5min - Step #2 95 °C 30sec - Step #3 55 °C 30sec - Step #4 72 °C 1min 30sec 2 19 - Step #5 72 °C 2min - Step #6 4 °C pause running time:? Agarose Gel Electrophoresis Gel Electrophoresis # 겔 전기영동은 전류를 흘려주어서 전하를 가진 입자가 겔 내부에서 이동하여 분리되도록 하는 기술이다. 아가로스 겔은 해상도는 낮지만 200bp에서 50kb까지 크기에 따라 이동 하는 속도차이로 분리할 수 있다. 즉, 작은 분자는 큰 분자에 비해 빠른 속도로 이동하기 때문에 결과적으로 서로 다른 크기의 분자들은 겔 상에서 서로 다른 위치에서 띠 모양을 나타내게 된다. 각각의 띠를 이루고 있는 분자들의 크기는 이미 크기를 알고 있는 분자들 을 나란하게 전기영동하여 겔 상에 나타난 띠의 상대적인 위치를 비교함으로써 그 크기 를 측정할 수 있다. # 전기영동은 이와 같은 원리를 이용하여 분자량 결정을 비롯하여 순도결정, 각 성분의 정 량, 정제 등에 이용되고 있으며, 단백질이나 핵산의 주된 분리분석법이 되고 있다. # DNA나 RNA의 경우 주로 아가로즈(agarose)를 사용하고, 단백질의 경우 폴리아크릴아 마이드(polyacrylamide) 등을 굳혀서 겔을 만든다. 졸-겔 전이 [ sol-gel transition ] # 졸과 겔이 온도, 압력, pH 등 외적 조건의 변화에 의해 한편의 상태에서 다른 편의 상태로 옮기는 것을 졸-겔 전이라고 한다. 계란을 삶는 과정은 졸→겔 전이의 가장 잘 알려져 있는 예이며 비가역적이다. 한천, carageenan, 젤라틴, methylcellulose 등은 열에 의한 가역성 반응이다. # 한천이란 우뭇가사리를 건조한 것으로 한천의 구조는 아가로스와 아가로 펙틴으로 불리는 다당류로 겔을 만드는 재료인 아가로스 이 한천을 정제하여 만든 것이다. 아가로스 농도에 따른 DNA 분리범위 # 아가로스 겔의 밀도는 아가로스의 농도(%)에 따라 결정된다. 아가로스 농도(%) DNA 분리 범위(kb) 0.3 5-60 0.6 1-20 0.8 0.8-10 1.0 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 DNA ladder http://www.axygenbio.com/ # Size 확인을 위해 흔히 marker를 사용하는데 size marker는 보통 파지 DNA를 제한효소로 잘라 사용한다. Features: ◦Ready-to-use ◦Includes bromphenol blue for ease of use ◦Stable at room temperature 실험: 아가로스 겔 전기영동 (1) 재료 및 장비 # EtBr(분자식: C21H20BrN3, - 아가로스 (agarose) 분자량: 394.33)은 DNA의 - 5x TAE buffe 검출에 사용하는 색소다. 2 - Ethidium bromide Stock 10mg/ml --> 최종농도 0.5 μg/ml 중 가닥 DNA의 GC결합 아가로스 겔 25ml당 EtBr stock은 2 μl 넣으면 적당하다. 반드시 보호 장갑(poly-glove) 끼고 할 것! - Gel loading buffer(6X) 사이에 정량적으로 끼어 들어가지만 외가닥 DNA 또는 RNA에서도 약하게 결합한다. 자외선에 의해 - DNA Size marker 주황색이 강한 형광을 보 - 100ml 삼각플라스크 이기 때문에 전기 영동 후 - 전자레인지,방열장갑 착용 or 목장갑 DNA분자의 검출에 자주 - 옐로우 파이펫 (2-20 μl), yellow tip, 파라필름(parafilm) 사용한다. 발암성 물질이 - 증류수 1리터 - Gel tray - 전기영동장치 - UV transiluminator 기 때문에 사용할 때에는 반드시 장갑을 사용해야 한다. (2) 실험방법 아가로스 겔 만들기 ① 0.8% 아가로스 겔을 만들기 위해 100ml 삼각플라스크에 25ml 1XTAE buffer와 0.2g 아 가로스 분말을 섞는다. ② 뭉친 분말이 없는 것을 육안으로 확인한 후 랩으로 덮고 증기가 빠지도록 구멍을 뚫어준 다. ③ 전자레인지를 사용해 1-3분 정도 지나 아가로스 입자가 완전히 녹으면 실온에 꺼내 기포 가 생기지 않게 부드럽게 흔들어 섞는다. Notice! 화상의 위험이 있으니 장갑 착용할 것 ④ 상온에서 50-60℃까지 식힌 다음 EtBr을 첨가한다. Notice! EtBr에 사용했던 tip은 따로 수거해서 폐기한다. ⑤ Gel tray에 겔을 붓고 comb을 꼽은 후 최소 실온에서 30분간 gel을 굳힌다. ⑥ 겔이 굳은 후 바로 사용하지 않을 겔은 빛이 차단되는 용기에 0.5XTAE buffer를 채운 후 완전히 담궈서 보관한다. ⑦ 겔의 홈(well)부분이 전기 영동 tank에 “–” 극 쪽에 위치하도록(DNA는 인산기가 음전하 를 띠기 때문에 –에서 +로 이동한다.) 넣고 0.5X TAE를 겔 위로 3mm까지 차도록 붓는다. 시료준비 및 전기영동 ⑧ loading buffer 1 μL에 sample 5 μL (elution buffer로 희석, 1:4)를 섞고 well(작은 well은 20 μL, 큰 well은 60 μL 까지 가능하다)에 조심스럽게 loading하고 여분의 well 에 DNA size marker 3 μL loading 한다. ⑨ 전원을 연결하고[black(-), red(+)] 전기영동을 약 30분간 100V로 걸어준다. ⑩ bromophenol blue가 겔의 2/3 정도에 오면 멈춘다. ⑪ UV transilluminator 관찰 Troubleshooting