Transcript Virus 검사에 PCR의 응용

Virus 검사에 PCR의 응용
발표 : R2 김영철
PCR을 이용한 virus 검사항목
• HPV (16,18)
• Polioma Virus (BK,JC)
- RFLP
• CMV
• Parvovirus
• HSV type 1,2
• HHV type 6
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Rhinovirus
Enterovirus
Coronavirus
Mumpes virus
HCV
Virus 검사에서 검체의 채취
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호흡기 검체- nasopharyngeal aspirate
대변- 발병 후 4일 이내에 채취
혈액- sodium citrate tube
뇌척수액- 혈액이 섞이지 않게
면봉검체- 수포성:26G 주사기
소변- 중간뇨 10 mL
기타검체- 마르기쉬운 검체: 운송배지
DNA 분리방법
• Lysis: 0.5% SDS, Proteinase K
• Purification of nucleic acid : Extraction with
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol
• Concentrating Nucleic acid: Ethanol
precipitation, sodium acetate
• DNA washing
• DNA solubulization
RNA 분리방법
• Lysis:Tri-reagent
• Phase separation: chloroforum
• RNA precipitation: isopropyl alcohol,
Glycogen
• RNA washing
• RNA solubulization
Coprecipitants
• During centrifugation, carriers generate a
visible pellet that facilitates handling of the
target nucleic acid
• Glycogen, Linear polyacryamide, Yeast
tRNA
Determination of DNA conc.
• Beer-Lambert Law
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•
dsDNA 50 ug/mL의 흡광도는 260 nm에서 1.00
sDNA 33 ug/mL의 흡광도는 260 nm에서 1.00
sRNA 40 ug/mL의 흡광도는 260 nm에서 1.00
Concentration of DNA (ug/mL)
= (A260-A320) X 50 ug/mL X dilution
• Measure of purity of isolated nucleic acid :
ratio of the absorbance at 260 nm and 280 nm
PCR 의 원리
• Denaturation
• Annealing
• Extension
PCR reaction mixture
Component
Template DNA
dNTP mix (10 mM each)
Primer A
Primer B
Taq polymerase
PCR buffer
D.W
Total volume
Vol./reaction
Variable
2 uL
Variable
Variable
0.5 uL
10 uL
100 uL
Final conc./reaction
< 1 ug/reaction
200 uM of each dNTP
0.1 –0.5 uM
0.1 –0.5 uM
2.5 U
The amount of PCR product
• Product =
2n x l x m
A
(n: number of heat cycle, l: lengnth of
amplified fragments in base pairs,
m: average mass of a base pair(constant),
A: Avogadro, number, 6 x 1023)
Detection
• Sensitivity of detection with ethidium bromide
– 10 ng of DNA가 검출될 수 있다.
• 기타 염색에서의 검출율
Polyester-backed polyacrylamide gel에서는
silver stainning을 하면 picogram까지 검출할
수 있다.
Quantitation of nucleic acids
• Absorbance at 260 nm by
spectrophotometer
• Emission at 458 nm in the presence of
Hoechst 33258 by fluorometer
• Dipstick (a kit from Invitrogen)
• Ethidium bromide spot test by
UV transilluminator
Staining nucleic acids
• Ethidium bromide
- staining DNA in gels(~10 ng/band)
• Methyene blue
• Silver staining
- < 1.0 ng of DNA
analyze single-stranded DNA by SSCP
• SYBR dyes
Summary
• Labor intensive하지만 bcr-abl gene
rearrangement 검사와 같이 1년에 몇 case
되지 않는 경우 기존 기구를 이용하여
setting할 수 있겠습니다.
• Nucleic acid 분리방법의 standard method
를 이해함으로써 상품화된 시약을 평가
할 수 있겠습니다.