Transcript 2주차_medium, agarose gel

2주차
생화학 및 분자생물학실험
Medium (liquid & solid)
Agarose gel
Content
1.
2.
3.
Purpose
- Medium (Liquid & Solid)
- Agarose gel
Introduction & theory
1) Medium
2) 세균의 배양 방법
3) 항생제 (Antibiotics)
4) 대장균 (Escherichia coli)
5) 멸균 (Sterilization)
6) Agarose gel
Materials & Methods
Purpose _ Medium (Liquid & Solid)
미생물 배양에 이용되는 다양한 배지와 역할에 대해 배워보고, 직
접 제조해봄으로써 생화학 실험에 대한 기초적인 테크닉을 익힌다.
Purpose _ Agarose gel
DNA를 분리하는데 이용하는 Agarose gel electrophoresis에 필요
한 Agarose gel을 만들어 본다.
Introduction & theory
※ 미생물 배양 시 고려 사항





배양하고자 하는 균주의 특성에 맞는 환경 조성
배지(medium)
온도(temperature)
pH
멸균(sterile)
Introduction & theory
1)



Medium
미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위해 필요한 영양물질들
을 혼합한 것
물을 비롯한 탄소원·질소원·무기염류 등의 영양 물질 공급
잡균의 번식을 저해하기 위해 반드시 멸균 필요
Introduction & theory
세균의 배양 방법
2)
a.
-
b.
-
현탁배양법
액체배지에 세균을 배양
증균 및 대사산물의 생산 등에 이용
고체배양법
고체배지에서 배양
세균의 보존 및 분리에 이용
Introduction & theory
3)
항생제
특수한 생화학 과정을 저해하여 배양체는 죽이지 않고 선택적으로 다른
세균의 성장을 저해시키는 화학물질
Introduction & theory
※ 항생제의 사용
미생물 배양 시 선택적으로 세포를 배양하기 위해 Vector의 정보에 맞는 항
생제를 넣어준다.
Introduction & theory
4)
-
대장균 (Escherichia coli / E. coli)
인간을 포함한 포유류의 대장에서 서식
호기성 혹은 통성혐기성의 Gram 음성균
포자를 형성하지 않는 간균
길이는 1~2 .5μm, 지름0.1~0.5 μm
다른 실험 생물들에 비해 증식 속도가 빠름
Molecular cloning 으로 주로 사용
Introduction & theory
※Cell wall 구조
• Lipopolysaccharide (Outer membrane)
• Murein (Peptidoglycan)
• Cytoplasmic membrane (Inner membrane)
- Role in microbiology
: E. coli 는 현대 생물학 기술에서 중요한 역할을 수행
DNA나 proteins을 대량 생산하고자 할 때 factories로 대장균을 주로 사용
(ex. human insulin)
Introduction & theory
5)
멸균(Sterilization)
시약, 물, 공기, 초자류 등에 다양한 미생물 존재
 배지에 오염되면, 원하는 결과를 얻을 수 없게 됨
따라서 미생물을 접종하기에 앞서 배지와 배양기 내의 모든 미생물
들을 사멸시키거나 제거하는 멸균과정 필요
Introduction & theory
a.
물리적 멸균방법
화염멸균
백금이나 백금선 또는 시험관이나 플라스크의 목 부분과 같이 불꽃에 직
접 접촉하여도 안전한 물건에 묻어 있는 미생물을 불꽃으로 태워서 죽이
는 방법
•
건열멸균
가열된 공기를 이용하는 방법으로 증기에 비해 열 전도율이 낮아 160 ℃에
서 1 h 이상 가열하며 주로 유리기구 등과 같이 고온에 안전한 물체를 멸균
할 때 사용하는 방법
•
Introduction & theory
습윤멸균
고온, 고압 수증기를 포화시킨 고압 멸균기(Autoclave)를 사용하며, 내
열성 포자는 100 ℃에서도 생존이 가능하기 때문에 121 ℃, 1.5기압에서
10~15분 정도 멸균하는 방법
•
여과멸균
열에 의하여 파괴되거나 변질되는 액상 물질을 공경이 약 0.2~0.45μM의
멸균된 여과지에 통과시켜 미생물을 분리/제거하는 방법
•
Introduction & theory
b.
화학적 멸균방법
Glutaraldehyde
의학, 치과용 장비를 소독하는데 주로 사용. 2% glutaraldehyde 용액은 살균
력이 강하고 부식성이 없으며 휘발성이 낮은 장점들이 있으나 피부, 눈과
같은 사람의 조직에 대하여 중등도의 독성을 나타냄
•
Alcohol
실험 장비를 소독, 멸균하는 데 사용하는 방법.
주로 70% ethanol 사용.
•
Introduction & theory
Ethylene oxide gas
ethylene oxide를 통과시켜 멸균하는 방법으로 광학렌즈, 플라
스틱 제품, 폴리에틸렌 제품과 같이 열에 약한 물품들의 멸균
에 주로 이용
•
•
phenol etc.
Introduction & theory
6)
Autoclave (고압습윤멸균기)
멸균의 필요성
세균의 내생포자를 파괴하기 위해서는
100 ℃이상에서 습열(moist heat) 멸균을
해야 하며, 이때 높은 증기압이 필요

Autoclave의 방법 (조건)
121℃, 1.5기압 상태에서 15분 진행

Introduction & theory
7)
a.
•
•
•
Agarose gel
Agarose
해초로부터 추출한 다당류.
Agarose와 물을 섞고 끓여 완전히 녹인 후 그 용액을 식히면 gel화되어
작은 구멍과 물로 채워진 망을 형성
구멍크기는 수백 nucleotide 또는 그 이상으로 된 핵산중합체를 분리하
는데 적합
<The structure of an agarose polymer>
Introduction & theory
b.
EtBr의 사용 목적
DNA는 자연적으로 무색
 방사성 동위원소 또는 EtBr과 같은 염
료로 염색함으로써 탐지
EtBr이 DNA의 염기쌍 사이에 끼어들어가
결합
 자외선에서 밝은 오렌지 형광을 냄
Materials & Methods
1.
2.
3.
LB (Luria Bertani) 만들기
고체배지 만들기 (100 ml 기준)
1% Agarose gel 만들기
LB (Luria bertani) 만들기
증류수, 삼각플라스크, 메스실린더, 저울, Petri-dish, Foil, Spatula,
Autoclave, LB broth, Agar powder, Ampicillin, Weight paper, Alcohol lamp
LB (Luria bertani) 만들기
액체 배지 만들기(50 ml)
- Tryptone 0.5 g
-Yeast extract 0.25 g
- NaCl 0.5 g
- DW 50 ml

고체 배지 만들기(100 ml)
- Tryptone 1 g
-Yeast extract 0.5 g
- NaCl 1 g
- Agar 1.5 g
- DW 100 ml

LB (Luria bertani) 만들기
1.
-
준비된 시약을 삼각플라스크에 모두 넣어준다. (50 ml 기준)
Tryptone 0.5 g
Yeast extract 0.25 g
NaCl 0.5 g
2.
매스실린더로 증류수 50 ml을 취해 시약을 담긴 삼각플라스크에 넣은
후 흔들어 녹여준다.
3.
액체 배지가 준비되면 Autoclave로 멸균을 해준다.
4.
Autoclave가 끝나고 50 ℃ (따뜻한 정도)로 식힌 후 필요에 따라 항생제
를 넣어준다. (Cell 배양 직전에 첨가)
고체 배지 만들기
1.
2.
3.
4.
준비된 시약을 삼각플라스크에 모두 넣어준다. (100 ml 기준)
Tryptone 1 g
Yeast extract 0.5 g
NaCl 1 g
Agar 1.5 g
D.W 100 ml
Autoclave로 멸균을 해준 후 천천히 식혀준다. (50 ℃ 이하)
식혀진 고체배지 용액에 원하는 항생제를 첨가 후 각각의 준비된
plate에 20~25 ml씩 분주하여 천천히 굳힌다.
고체배지가 다 굳으면 Wrap으로 싸서 냉장 보관한다. (4 ℃)
※ 주의사항 : 고체배지 분주할 때는 알코올 램프를 반드시 켜고 할 것.
1% Agarose gel 만들기
증류수, 삼각플라스크, 메스실린더, 저울, 0.5X TAE buffer, Spatula, Microwave,
Agarose, EtBr, Gel-tray, Comb, Pipette, tip, Weighing paper, Poly glove
1% Agarose gel 만들기
1.
2.
3.
4.
5.
5.
6.
7.
0.5X TAE 50 mL에 0.5 g의 agarose를 첨가하여 흔들어 준다.
전자레인지에 1분 동안 돌려 agarose를 녹이고, 다 녹지 않
았다면 1분 정도 더 돌려준다.
완전히 다 녹인 후 60 °C정도로 온도가 낮아질 때까지 식힌
다.
Ethidium bromide(10 mg/mL in DW)를 2.5 µL 따서 넣어주
고 흔들어 준다. (Final 0.5 µg/ml)
Gel-tray에 gel을 서서히 부어주고 bubble이 생겼으면
disposable tip을 사용하여 side 벽면으로 밀어 제거한다.
Comb을 꽂아준다.
30분 이상 gel이 굳을때까지 가만히 둔다.
0.5X TAE buffer로 채워져 있는 보관통에 넣어 보관한다.