Transcript 조류생물학

Isolation of E.coli Genomic DNA
실험 재료: 대장균
# 학명 Escherichia coli.Escherichia속 세균의 1종이다. 사람을 포함해서 포유류의 장관을 기
생장소로 하고 있는 장내세균으로, 통성혐기성 그람음성의 간균이며 글루코오스를 분해하여
산을 생산한다. 사람이나 동물의 분변에 오염된 외계에 널리 존재하기 때문에 음료수, 수영장
이나 식품의 변질에 의한 오염을 검사하는 지표가 되며 특히 대장균K12주(E. coli K-12)는
분자생물학과 생물공학의 연구재료로서 널리 이용되어 왔다.
원리
# 세포로부터 염색체 DNA를 분리하기 위해서는 먼저 DNA가 세포 밖으로 유출될 수 있도
록 세포벽 및 세포막을 분해시켜야 핚다. 이 때 DNA 가수분해 효소들의 활성을 억제하
는 조건에서 DNA를 분리해야 하며, 단백질이나 RNA가 같이 회수되지 않도록 해야 한
다.
# 세포벽을 가지는 박테리아의 경우에는 먼저 EDTA를 처리하여 세포벽을 분해시키며
세포막은 세척제(detergent)인 SDS를 처리함으로써 분해시킨다. SDS는 세포막을 분
해시킬 뿐 아니라 단백질을 변성시킬 수 있어 핵산 가수분해 효소들의 작용을 억제할
수 있다. 효소를 포함하는 세포 내 단백질들은 proteinase K에 의해 분해되고 분해된
단백질들은 phenol과 chloroform을 처리함으로써 제거할 수 있다. DNA는 알코올에
의해 침전되고 남아있는 RNA는 RNase에 의하여 가수분해되어 제거되고 최종적으로
DNA만을 얻는다.
실험: 박테리아 염색체 DNA 분리
(1) 재료 및 장비
- 배양된 박테리아 세포
- TNE 완충 용액(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)
- 0.5M EDTA 용액
- 10mg/ml proteinase K
- 20mg/ml RNase A
- 10% SDS
- Phenol:Chloroform:Isoprophylalcohol(PCI)
- Chloroform
- 3M NaOAc(sodium acetate)
- 70%,100% 에탄올(ethanol)
- 원심분리기
- 항온수조
- 1.5ml 미량원심분리 시험관(Eppendorf tube)
- 파이펫
(2) 실험방법
1. 박테리아의 배양액 1.5ml을 원심분리 시험관에 옮기고 12000rpm, 30초 원심분리하여
상등액은 버리고 세포 침전물을 얻는다.
2. 세포 침전물을 500μl의 TNE 완충용액에 현탁시킨다.
3. 박테리아의 세포벽을 제거하기 위하여 0.5M EDTA 60μl를 넣고 얼음에 10분 동안 박아
둔다.
4. 10% SDS 70μl와 10mg/ml proteinase K 10μl를 첨가하고, 55℃에서 20분 방치하여
세
포 내 단백질을 분해시킨다.
5. 분해된 단백질을 제거하기 위하여 같은 양의 PCI을 넣고, 1분 동안 30rpm으로 회전교반기
에서 섞어준 후 12000rpm, 10분 동안 원심 분리한다.
6. DNA를 포함하는 수용액 층인 상등액을 새 미량원심분리 시험관에 옮긴 후 잔여의 단백질과
페놀을 제거하기 위하여 동량의 chloroform을 넣고, 1분 동안 30rpm으로 회전교반기에서
섞어준다.
7. 12000rpm, 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 새 미량원심분리 시험관에 옮긴다.
8. 6,7번 과정 한번 더 반복한다.
9. 1/10 부피의 3M NaOAc 용액을 넣고 잘 섞어준다.
10. 2배 부피의 100% 에탄올을 넣고 잘 섞어준다. -20℃에서 over night 한다.
11. 12000rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 DNA 침전물을 얻는다.
12. 70% 에탄올 1ml로 세포 침전물을 닦아 잔여의 염분을 제거한다.
13. 침전물을 100μl의 TE완충용액에 잘 녹인다.
14. 20mg/ml RNase A를 10μl 넣고, 37℃에서 30분간 두어 RNA를 제거한다.
15. 사용할 때까지 -20℃에 보관한다.
핵산 정량법
Nanodrop