Transcript 11주차_Cell lysis and Column packing

11주차
생화학 및 분자생물학실험
Cell lysis
Column packing
Contents
1.
Purpose
1.
Introduction & theory
- Cell lysis methods
- Inclusion body
- Centrifugation
- Protease
3.
Materials & method
Purpose

Cell lysis 방법들과 Centrifugation 종류들이 무엇이 있는지 알아본다.

Inclusion body가 생기지 않게 하기 위해서 우리가 무엇을 해야 하는지 알아본다.
Introduction & theory
1.
Cell lysis(cell distruption) methods
1)
Physical methods
① Rotor-stator Processors
 가장 쉽게 접할 수 있는 물리적 용해 방법.
 회전 칼날로 cell을 분해하는 하는 방법.
 Blender, polytron 등이 있다.
 단점
 용해 되기 어려운 효모나 진균류에는 잘 동작하지 않는다.
 단백질의Yield가 일정하지 않은 경우가 많음.
Introduction & theory
1.
1)
Cell lysis(cell distruption) methods
Physical methods
② Valve-type processors
를 이용해 고압으로 눌러주는 좁은 공간 사이로
샘플을 흘려
주어 압으로 인해 cell이 뭉겨져 파괴되게 하여 lysis하
는 방법.
 Homogenizer, French press 등이 있음.
 단점
- 고압으로 인해 생기는 열에 인해
단백질이 변성될 수 있음.
- 큰 volume의 sample에는 적용 불가.
 Valve
Introduction & theory
Cell lysis(cell distruption) methods
1) Physical methods
1.
③
Fixed-geometry fluid processors ( = Microfluidizer )
 Valve 로 압력을 주는 것이 아닌, 유압을 통한 압력을 주는
방법.
 상대적으로 넓은 공간에 있는 sample을 강한 유압을 통해
순간적으로 매우 좁은 공간으로 보내면서 생기는 병목 현
상을 통해 cell을 파괴하는 방법.
 Valve 타입에 비해 대량의 sample 활용이 가능하고,
control도 편하다.
 단점
 유압으로 흘려주는 방식이다 보니 lysis 과정을 여러 번 진행해
야 한다.
 고압으로 인해 생기는 열에 인해 단백질이 변성될 수 있음.
 Dilution에 의해 Sample 농도가 연해짐.
Introduction & theory
Cell lysis(cell distruption) methods
1) Physical methods
1.
④
Sonication
 초음파 영역( 20 ~ 50kHz ) sound wave를 이용하여 생기는
수증기가 다시 터지면서 생기는 충격파를 이용하여 cell을
파괴하는 방법.
 초음파를 일정한 pulse로 주면서, sample에 가하는 에너지
를 조절.
 단점
 고온의 열을 발생시키므로, 열에 약한 단백질을 변성시킬 우려
있음.
 소량의 sample ( 100mL )에서 사용해야 함.
 소음이 매우 큼.
 단백질의 yield가 일정하지 않는 경우가 많음.
Introduction & theory
1.
Cell lysis(cell distruption) methods
1)
Physical methods
⑤ Freeze & Thaw process
 물이 얼면서 나타나는 부피 변화, 육각 결정구조 형성
에 의해 cell이 찔리거나 수축 및 팽창하게 되면서 파
괴됨.
 얼리는 것은 -70℃ ethanol, liquid nitrogen, dry ice 등으
로 하고, 녹이는 것은 37℃ bath에서 진행한다.
 단점 : 단백질 또한 물의 육각 결정구조에 의해 깨질수
있다. 단백질 또한 얼었다 녹음을 반복하게 되면서 구
조적 변화가 일어나는 경우도 있다.
Introduction & theory
1.
Cell lysis(cell distruption) methods
2)
Chemical methods
 Detergent methods, Enzyme methods 등이 있음.
 Detergent methods의 경우, 세포벽을 뭉개기 위해 EDTA를 같
이 넣어주기도 함.
 DNA prep 혹은 발현 양을 확인 하기 위해 SDS-PAGE sample을
만드는 등의 확인용으로 이용.
 대량의 단백질을 lysis하는 경우에는 detergent에 의해 단백질
이 denaturation되거나 enzyme 들에 의해 잘려질 수 있기 때문
에 사용하기 어려움.
Introduction & theory
2. Inclusion body
1)
Inclusion body의 정의

단백질이 E.coli 내에서 과다 발현 되는 경우, folding이 제대로 형성되기 전
단백질 간의 hydrophobic interaction에 의해 생성 되는 용해 되지 않는 단백
질 덩어리.
Folding이 제대로 되지 않음 → 소수성 잔기의 노출
→ 소수성 잔기가 노출 된 단백질들 끼리의 결합.

Introduction & theory
2. Inclusion body
2)
①
Inclusion body를 막는 방법
제대로 된 folding을 형성 하게 도와주는 방법
 Fusion tag protein 이용
- 발현하려는 단백질 앞에 folding을 도와줄 수 있도
록 fusion protein의 sequence를 넣어주어, solubility
를 높이고 단백질의 folding을 도움.
- Trx, Nus, MBP, GST tag 등이 있음.
 Chaperon과 함께 co-expression 하는 방법
 Chaperon : 미성숙하고 비정상적인 polypeptide을
완전한 구조를 갖도록 접힘을 돕는 단백질의 총칭.
Introduction & theory
2. Inclusion body
2)
②
Inclusion body를 막는 방법
발현 조건을 바꾸어 주는 방법
 E. coli 내의 단백질 발현 속도를 늦추어 발현 양 자체를 감소시키는 방법
1.Temperature 조절 : 낮은 온도에서 induction하여, 단백질의 발현속도를
늦추어 발현 양 자체를 감소시켜 막는 방법.
2. Shaking 속도 조절 : induction 시 RPM 값을 낮추어 E. coli 내에서
단백질들 간의 유효 충돌 횟수 감소 및, 발현 속도 감소를 유도하는 방법
Introduction & theory
3.
Centrifugaion
1)
원심 분리
: 원심력에 의해 액체중의 고체입자 또는 액체미립자를 분리하는 조작
Introduction & theory
2)
Subcellular Fraction

800 X gravity(10 min) : Nuclei sediment

15,000 X gravity(10 min) : Mitochondria, lysosome, and peroxisomes sediment

100,000 X gravity(60 min) : Fragments of the plasma membrane and endoplasmic
reticulum sediment

200,000 X gravity(3 hours) : Ribosomes sediment
Introduction & theory
3)
원리 분리의 종류
 원심분리기의 회전속도에 따른 분류
 저속 원심분리(low-speed centrifug)
• 일반적으로 6000rpm 이하의 속도를 낼 수 있음
• 속도와 온도의 정밀한 조절이 어렵고 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의
원심분리에 이용
 고속 원심분리기(high-speed centrifuge)
• 최고속도가 20000~25000rpm으로 냉각장치를 갖추고 있음.
• 주로 세포, 핵, 세포내 소기관 등의 분리에 이용
 초원심분리(ultracentrifuge)
• 최대속도가 40000~80000rpm으로- 냉각기와 진공장치를 갖추고 있음
• 세포, 핵, 세포 내 소기관, 세포막 구성성분, 리보솜 등의 분리에 이용
Introduction & theory
4. Protease

Protease inhibitor
 E. coli 안에 있는 protease들이 발현한 protein을 분해해버리는
경우가 많다. 그렇기 때문에, 우리가 원하는 단백질을 얻기 위해선
protease inhibitor가 존재가 필수적임.

Protease inhibitor 작동 원리
① protease의 active site와 결합하여 protease와 protein 간의
반응을 억제
② active site의 변형을 일으켜 protease와 protein간의 반응 억제
③ Protease의 co-factor를 제거하여 potease 활성을 없애버림.
Introduction & theory
4. Protease

Protease inhibitor
 Protease inhibitor 종류
 Cysteine protease inhibitors
 Serine protease inhibitors (serpins)
 Threonine protease inhibitors
 Aspartic protease inhibitors
 Metalloprotease inhibitors
Introduction & theory
4. Protease
 Protease inhibitor
 PMSF (phenylmethanesulfonylfluoride)
 대표적인 serine 계열 protease inhibitor
 Active site를 뭉게 protease의 활성을 억제한다.
 Degradation이 빠른 단점이 있다. ( 상온에서 30분 )
 Protease inhibitor cocktail
 여러 종류 계열의 protease inhibitor를 한번에 섞어 놓은 것.
 가장 많이 사용하나, 가격이 비싼 단점이 있다.
Introduction & theory
5.


Affinity column
Nickel column
Histidine을 이용한 tag(His-tag)을
붙인 target protein을 affinity
chromatography에 이용하기 위한
resin.


GST affinity column
Glutathione-S-Transfrase를 이용한
affinity column
Introduction & theory
Column packing
: Column body에 정확한 양의 resin을 채우는 작업을 일컽으며, 이 과정에 따라
purity등에 다양한 영향을 미치므로 정밀하게 작업을 해야 한다.

Materials & Methods
1.
Cell lysis(cell distruption)

Harvest한 pellet을 1X protease inhibitor cocktail과
1mM PMSF가 첨가 된 1X PBS bfr에 resuspension한다.
Resuspension 한 cell을 microfluidizer와 sonicator를
이용하여 lysis 한다. ( 조교가 진행 )
Sonicator lysis condition Microfluidizer lysis condition
On : 5 sec
Sample volume : 50mL
Off : 10 sec
Lysis pressure : 15000 psi
Count : 30 times.
Repeat : 3 cycle
Power : 60%

Materials & Methods
1.
Cell lysis(cell distruption)

Lysis 한 sample 을 12000RPM, 4℃, 20min centrifuge하여 supernatant과 pellet
을 구분한다.

Supernatant 만 따로 취하여 4℃에 보관 한다.
Materials & Methods
2.
Column packing

깨끗이 씻은 column 입구를 막고 우리가 넣을 resin volume 만큼 물을 첨가하여
높이를 체크한다.

입구를 다시 열고, 체크한 높이만큼 resin을 붓는다.

Resin 을 수평이 되도록 맞추고, 물로 먼저 washing 한 뒤, 1x PBS로 equilibration
잡는다.