Transcript 10주차_Over expression, cell harvest
생화학 및 분자생물학실험
Over expression Cell harvest 10 주차
Content
1.
Abstract 2.
Introduction & theory • lac operon • • E.coli cell growth curve Optical density of 600nm 3.
Materials & methods 4.
Results
Purpose
E. coli의 growth curve 및 growth factor를 이해하고, 각 요소들이 단백질 over-expression과 연관되는지 알아본다.
Introduction & theory
1.
Lac Operon 1) Operon : 세균의 DNA에 존재하는 것으로, 하나의 promoter에서 부터 전사되는 유전자들의 집단.
2) lac operon : E. coli가 lactose를 분해하여 에너지 원으로 이용하기 위해 필요한 효소 생산에 관여하 는 유전자들의 집단.
3) β-galactosidase (lac Z) : lactose를 galactose와 glucose로 분해하거나 allolactose 생성.
Introduction & theory
1.
Lac Operon 4) Negative regulation ( repressor( lac I ) ) - Lac operon 내의 Lac I 라는 gene에서 형성되는 repressor에 의하여 조절.
repressor는 tetramerization function이 있음.
Glucose의 양이 많은 경우 ( Lactose or Allolatose가 존재 X )
Repressor가 operator에 붙어 promoter에 RNA polymerase가 붙는 것을 억제 시 킨다. (전사가 일어나지 않음)
Glucose의 양이 적은 경우 ( Lactose or Allolactose가 존재 O )
Repressor에 lactose가 붙어 repressor의 구조를 변화시킴.
구조가 변한 repressor는 더 이상 operator에 붙지 못하게 되고, RNA polymerase 는 자연스럽게 promoter에 붙어 전사 유도.
Introduction & theory
1.
Lac Operon
4) Negative regulation ( repressor( lac I ) )
Introduction & theory
1.
Lac Operon 5) Positive regulation ( cAMP, CAP complex ) 특정한 경우 operator로부터 repressor를 제거하는 것만으로 operon을 작동 시키기에는 충분한 조건이 아닐 수 있음.
cAMP : E. coli 내 포도당의 농도가 낮음을 알리는 신호 역할.
포도당이 부족할 시 cAMP가 합성됨, cAMP는 CAP과 complex를 이룸. cAMP-CAP complex는 lac operon 내 activator site(CAP site)에 결합하여 RNA polymerase를 promoter에 강하게 결합하는 역할을 함.
Glucose의 양이 많은 경우 ( Lactose or Allolatose가 존재 X )
Glucose가 많은 상태에서는 cAMP가 많이 존재하지 않으므로, RNA polymerase와 promoter 간의 결합 세기가 증가하지 않음.
Glucose의 양이 적은 경우 ( Lactose or Allolactose가 존재 O )
cAMP가 CAP과 complex를 이룬 후 CAP site에 붙어 RNA polymerase가 promoter에 강하게 결합하게 함.
Introduction & theory
1.
Lac Operon Negative regulation & Positive regulation
(b) Without bound activator (CRP-cAMP), the lac promoter is poorly transcribed even when lactose concentrations are high and the Lac repressor is not bound. >
Introduction & theory
1.
Lac Operon 6) IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)
Allolactose IPTG
둘 다 repressor에 붙는 점은 동일하나, β-galactosidase 에 의해 잘리는 부근의 차이 로 allolactose는 대사가 되지만 IPTG같은 경우는 대사되지 않음. ∴ 지속적인 전사 가능! = induction
Introduction & theory
1.
Lac Operon 6) IPTG Induction
lac I CAP Pomoter Operator lac Z lacY lac A 지속적인 전사 ⇒ over expression 의 시작 IPTG Repressor RNA polymerase 지속적 저해
Introduction & theory
1.
Lac Operon 6) IPTG Induction – Inclusion body - Inclusion body란 폴딩과정 중 부분적으로 접혀진 중간물질 분자들 사이에 노출된 소수성 부위들 간의 비공유성 결합에 의해 folding 과정이 off-pathway 로 진행되어 생긴 것을 말한다 - 외래 단백질이 E.coli
내에서 과발현 되는 경우, folding이 제대로 형성되기 전 단백질 간의 hydrophobic interaction에 의해 생성되는 용해되지 않는 단백질 덩어리
Introduction & theory
1.
Lac Operon 6) IPTG Induction Refolding : Urea, Gu-Hcl 등과 같은 변성제를 넣어 Unfolding 시킨 후 다시 변성제의 농도를 점차 낮춰주어 Protein structure 를 refolding 하는 방법 http://yxsj.baiduyy.com/whole/image/chapter2/2.43.jpg
Introduction & theory
1.
Lac Operon 6) IPTG Induction Chaperone 단백질의 입체적 구조 형성을 돕는 단백질인 folding 을 돕는 방법 Chaperone 을 제공하여 Protein
Introduction & theory
1.
Lac Operon 6) IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) (1) Fast induction 모든 단백질에서 다 작동하지는 않는다.
Sub-optimal한 yield를 얻을 수 있다.
주로 30℃, 37℃ 조건으로 많이 한다.
(2) Slow induction 몇몇 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다.
주로 18℃ 정도로 ( 30℃ 이하 ) 조건을 많이 잡는다.
Introduction & theory
2.
E.coli cell growth curve
Introduction & theory
2.
E.coli cell growth curve # 접종(inoculation) : 배양을 위한 선행 과정, 시료(inoculum) 를 미생물들 이 증식할 수 있는 배지에 심는 것.
1) 2) Lag phase : 접종한 E.coli
가 새로운 환경에 적응하는 시기. RNA의 함량이 증가하고 효소 활성이 강해져 증식을 준비하는 시기.
Log phase : E.coli
의 대사가 활발해지고 규칙적으로 이분열하여 증 식 곡선상에서 일직선적인 상승이 일어나는 시기. 세포의 수가 지수 적(X2)으로 증가하는 시기.
cf) E. coli 의 이분열 소요 시간 : 20분, Yeast 이분열 소요 시간 : 2시간, Mammalian cell 이분열 소요 시간 : 20~24시간
Introduction & theory
2.
E.coli
cell growth curve 3) Stationary phase : E.coli
의 사멸 개체수와 새로 생성되는 개체수 값이 같아지는 시기. ( 마치 정지된 것처럼 ) 영양분의 소실, 부족, 노폐물이 축적, pH 변화 등으로 세균의 분열 속도가 낮아지고 일부분의 세균이 사멸하게 되기 때문.
4) Death phase : 세균의 사멸과 악화에 의해 생균수의 감소가 일어나기 시작함. 생 산된 산(acid)에 의해 pH가 저하하며 사멸을 촉진하는 시기.
이런 성장곡선은 배지의 영양분 조성 차이, 키우는 E.coli
종류, 증식 조건 (온도 등)에 따라 다른 곡선을 나타낼 수 있다.
Introduction & theory
3.
OD 600nm (Optical density) 1) Optical density : 일정한 세기를 가진 어떤 파장의 빛이 용액 층을 통과한 후, 광도 가 그 일정세기로 될 때의 양. 600nm의 파장에서 E. coli는 log phase상태에서 가 장 최적의 scattering과 absorption이 발생함.
600 nm를 E. coli 농도 측 정에 사용!
Materials & Methods
1.
Over expression ① ② ③ 전배양 : pRSET-lacZ DNA를 BL21(DE3)-pLysS에 transformation한 plate에서 colony를 골라 5 mL LB media (antibiotic : Ampicilin, chloramphenicol) 에 접 종 후, 37 ℃, 200 RPM, 16~18 hour (over night)으로 키운다.
본배양 : 25 mL LB media에 Ampicilin, chloramphenicol 을 각각 25 uL씩 넣고 전배양한 cell 500 uL 취해 접종한 후 (1 : 50), 37 ℃, 200 RPM으로 OD 600nm = 0.5~0.6까지 키운다.
Induction : OD 600nm = 0.5~0.6 까지 키운 sample에 1 mM IPTG 첨가 후 37 ℃, 200 RPM, 3 hour induction
Materials & Methods
2.
Cell harvest ① Induction이 끝난 sample을 8000RPM, 4℃, 20min 간 centrifuge한다.
② Centrifuge 후, supernatant를 버리고 pellet만 -20℃에 보관한다.