Transcript DNA microarray differential expression 한 유전자

서강대학교
Sogang university
DNA microarray를 이용
한 유전자 differential
expression 정량측정 실험
담당 교수님 : 김건수 교수님
담당 조교님 : 김익중 조교님
20050718 생명과학과 안혁근
Contents
1. Introduction
2. Method
3. Data & Result
4. Discussion
Introduction
- Purpose
High-throught 방법인 DNA chip을 이용하여 조건에 따라 달리 발현되
는 세포 내 유전체상의 유전자들을 스크리닝하고 그들의 발현 양상을
정량적으로 분석한다.
- Theory
배경 : 세포의 생명현상을 분자수준에서 이해하기 위해서는 세포 내의 유
전자들의 발현 양상을 파악하는 것이 중요 !!
몇 개의 유전자의 발현만 측정할 수 있는
Nothern hybridization의 한계를 극복하기 위해
전체 유전체를 이루는 유전자들의 전사 정도를 동시에 측정 가능한
DNA microarray 등장 !!
Introduction
DNA microarray의 과정
Introduction
유전자 발현을 측정하기 위한 microarray 실험은 5단계로 나눌 수 있다.
•
1 step : DNA chip 제작하는 단계. DNA chip에는 수천에서 수만 종류
의 유전자 서열을 고정한 것이다.
•
2 step : 실험 조건에서 RNA(역전사효소를 사용하여 RNA로 부터 얻
어낸 cDNA)을 추출하여 형광물질로 표지하는 단계.
•
3 step : 표지된 RNA(cDNA)를 DNA chip에 뿌려 혼합(hybridization)
하는 단계. RNA(cDNA)는 DNA chip 위의 유전자와 상보적인 결합을
한다.
•
4 step : RNA(cDNA)와 반응한 DNA chip을 스캐닝하여 이미지로 형
상화한 후 프로그램을 이용하여 유전자 위치마다 형광물질에 따른 발
색강도를 측정하는 단계. 형광 강도는 그 유전자의 발현정도를 알려준
다.
•
5 step : 정량화된 유전자 발현 수치 데이터를 분석하는 단계
Introduction
Microarrayer의 구성
Method
실험에서 사용한 균들
: S.typhi , S.flexneri , E.coli H7:0157 ,
V.choleae , V.parahaemolyticus, V.vulnificus
DNA chip 제작
1) 각 균들에서 뽑은 DNA를 PCR과정을 통해 증폭시킨다.
-PCR(Polymerase Chain Reaction)
: Template DNA, dNTP, Taq polymerase, primer 를 넣고 아래의
그림과 같이 denaturation, annealing, extention 3과정을 1 cycle로
하여 30 cycles정도 돌려준다.
Method
Method
-PCR 과정시 주의해야 할 사항
: 올바른 primer 선택이 중요하다
Primer 선택시 주의해야 할 사항
• 20~25mer 정도의 염기가 바람직하다.
• 두 primer가 비슷한 Tm값을 갖도록 한다.
• GC함량은 40~60%로 하는 것이 좋다
• Primer끼리 결합하여 dimer가 형성되지 않도록 한다.
• 부분적으로 GC 또는 AT가 리치하지 않도록 하고 특히 primer의
3’측면에 GC가 리치하지 않도록 한다.
• 자기 상보 배열을 포함하지 않아 헤어핀 구조가 생기지 않도록
한다.
Method
2) PCR이 제대로 되었는지 확인하기 위하여 electrophoresis를 해준
다.
- agarose gel의 well에 dye를 섞은 DNA와 ladder을 넣고 100V의
전압을 걸어준다.
- 10분정도 전기영동을 해준 후 gel을 EtBr용액에 담구어 염색을 15
분정도 해준 후에 UV 광학기를 통해 관찰한다.
Method
3) Elution 과정을 거친다.
- PCR purification kit protocol
•Buffer PB와 sample을 1:5의 비율로 섞고 mixture을 spin column에
옮겨준다.
•1분간 centrifuge 시키고 tube에 걸러진 액체는 버린다.
•Buffer NW 700㎕ 을 넣고 1분간 centrifuge시키고 tube에 걸러진 액
체는 버린다.
•Buffer NW 300㎕ 을 넣고 2분간 centrifuge 시키고 tube에 걸러진 액
체는 새로운 1.5㎕ tube에 옮긴다.
•Buffer EB 50㎕ 을 spin column 가운데에 뿌리고 1분간 기다린 후 그
다음 1분간 centrifuge 시킨다.
Method
- GEL kit protocol
•Elution 할 gel을 자른 후 무게를 잰다.
•Tube에 담아 gel부피의 3배만큼의 buffer GB를 넣어준다.
•50℃ 의 물에 agarose gel이 잘 녹을 수 있도록 5~10분간 넣어둔 후
2~3분 마다 vortexing 해준다.
•Isopropanol을 gel의 부피만큼 넣어준 후 mixture을 spin colmn에 옮
긴다.
•1분동안 centrifuge 한 후 spin column에 남은 용액을 버린다.
•Buffer NW700㎕ 을 넣고 5분 동안 wash solution이 흐를 수 있게 기
다린다.
•1분 동안 centrifuge한 후 tube에 남은 액체를 버린다.
Method
•Buffer NW 300㎕ 을 넣고 2분 동안 centrifuge한 후 spin column을
새로운 1.5ml tube에 옮긴다.
•Buffer EB 50㎕ 을 spin column의 가운데에 넣고 1분간 centrifuge한
다.
4) 만든 시료를 slide에 spotting한다.
- DNA의 농도를 DMSO와 섞어 농도를 모두 25μg/ml(ng/μl) 로 맞춘다.
- 384well-microplate에 arry pattern을 고려하여 넣어준다.
- Microarryer로 slide에 spotting 한다.
Method
DNA가 잘 붙도록 coding된 슬라이드와 균들의 위치
P : Positive control
N
N : Negative control
1
P
1 : V.cho
2
4
3
5
6
2 : V.par
3 : V.vul
4 : S.typhi
5 : S.flex
6 : E.coli 0157
Method
DNA chip에 뿌려 줄 시료 제작
1) 각 균들로 부터 RNA를 추출하고 reverse transecriptase를 이용하
여 cDNA를 합성한다. ( RNA preparation kit 이용)
2) cDNA에 Cy3와 Cy5를 labelling한다.
: 이 실험에서는 V.vulnificus의 DNA에 Cy3를 cDNA에는 Cy5를
labelling하여 DNA chip에 뿌려주었다.
Method
DNA chip에 Cy3와 Cy5로 label된 probe를 hybridization 시킴.
-완성된 slide 위에 공기방울이 생기지 않게 뿌리고 cover slide를 닿
고 14시간 정도 기다린다.
- 14시간 후에 slide를 washing solution으로 약 6번정도 씻어준다.
Hybridization 된 slide를 scanner로 관찰하고 분석한다.
Data & Result
각 균들의 PCR 결과
S.typhi primer에 대한 결과
S.flexneri primer에 대한 결과
Data & Result
각 균들의 PCR 결과
E.coli 0157 primer에 대한
결과
V.cholerae primer에 대한
결과
Data & Result
각 균들의 PCR 결과
V.vulnificus primer에 대한
결과
V.parahaemolyticus primer에
대한 결과
Data & Result
각 균들의 PCR을 한 결과를 electrophoresis로 확인한 모습
1 : S.typhi
2 : S.flexneri
3 : E.coli H7:0157
4 : V.choleae
5 : V.parahaemolyticus
123456
6 : V.vulnificus
Data & Result
Hybridization 된 slide를
scanning한 결과
Positive control
V.vulnificus
Data & Result
Damaged
substrate
80 40 20 10 5
(μg/ml(ng/μl))
comet
Data & Result
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12
Damaged substrate, edge fading, low signal intensity
Discussion
- Comet이 나타난 이유
•Slide에 loading할 때 DNA의 농도가 너무 높았기 때문
•DNA가 slide에 제대로 고정되지 못했기 때문
•Slide washing이 제대로 되지 않았기 때문
•Slide에 결함이 있기 때문
-Damaged substrate가 나타난 이유
•Cover slide가 slide 표면을 긁어 손상되었기 때문
•Washing할 때 slide 표면이 손상되었기 때문
•Spotting 할 때 핀이 slide 표면에 손상을 주었기 때문
Discussion
-Edge fading이 나타난 이유
•Cover slide를 덮을 때 target을 희석시켰기 때문
•Target이 slide에 고르게 펴지지 않았기 때문
-Low signal intensity가 나타난 이유
• 시료가 불순수하거나 농도가 적당하지 않았기 때문
• Hybridization이 제대로 되지 않았기 때문
• 부적당한 RNA
• Labellng이 제대로 되지 않았기 때문
• Scanner에 결함이 있기 때문
Discussion
Microarray의 전망
한 번의 hybridization으로 매우 많은 정보를 얻을 수 있는 유용한 기술
•
필요한 시료의 양을 줄일 수 있게 개선
•
arrayer의 가격을 낮춤
여러 실험에 보편화 기술로 자리 잡을 것이다.
Thank you .