시스템 생물학과 4학년 정승연 Mass Spectrometry
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생물리학 발표 PPT
Mass Spectrometry
시스템 생물학과 4학년 정승연
시스템 생물학과 4학년 정승연
Quattro microTM LC-MS/MS system
GCT Premier GC/MS
LCT Mass Spectrometer
Thermo Finnigan Trace GC/MS
http://www.ucd.ie/cscb/main_pages/facilities/mass_spectrometry.htm
Mass Spectrometer
MALDI ToF
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Thermal_ionization_mass_spectrometer.jpg
http://www.ucd.ie/cscb/main_pages/facilities/mass_spectrometry.htm
Thermal ionization MS
이 기계는 초전도 자석 내에서
이온의 회전 주파수를 측정해
분자무게를 측정하는 장비로,
http://blog.daum.net/obk2030/16514054
가장 가벼운 분자인 수소분자의
100만분 1의 무게 차이도 정확
히 측정할 수 있는 초정밀 장비
입니다.
한국기초과학지원연구원 – 15T FT-ICR MS’
Mass Spectrometry란
•
MS, 질량분석법
•
전체 질량의 0.01%, Small organic molecule의 500만분의 1에 달하는 정확도
•
매우 높은 민감도
•
다양한 물질에 사용가능
–Proteins
–Oligonucleotides
–Oligosaccharides
–Lipids
–Others
•
Proteomics 에 활용
* 단점 : 고가, 고 진공, 고전압, 높은 유지비 등이 있음
Mass Spectrometry의 과정
• 주입 시스템 : 먼저 시료를 도입한다.
• 이온 발생원(Ionization source) : 시료분자의 이온화, 더 작은 이온으로 쪼갬
• 질량 분리기(Mass analyzer) : 이온을 질량 대 전하 비로 선택적 분리
• 검출기(Detector) : 이온 흐름을 그 양에 비례하는 전기적 흐름으로 전환, 증폭
시켜 signal을 생성
Mass Spectrometry의 과정
Q. 분석하려는 시료를 이온화를 하는가 ?
Q. 진공시스템은 왜 필요한가 ?
MS 분류하기
Ion source
1. Electrospray
Ionization(ESI) 액체
Mass
Selection
–Atmospheric Pressure Ionization (APCI)
–Chemical Ionization (CI)
–Electronic Ionization (EI)
2. Matrix Assisted Laser
DesorptionIonization
(MALDI)
고체
Detector
3. Time of Flight(TOF)
4. Quadrupole
–Magnetic Sector
–Ion Trap
–Ion Cyclotron
–Phosphor / Photo Diode
5. Multi-channel Plate
(MCP)
Ionization의 종류
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=777579&cid=559&categoryId=559
Ion source : ESI
분자량이 10만 이상인 폴리펩티트, 단백질, oligonucleotide
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_esi.html
• 1984
•포름산 같은 산성 용액 사용
•(+)charge의 반발력 사용
보통 MS는 m/z가 1,500 이하
인 곳에서 분해능이 뛰어나다.
ESI 방법을 사용하면 전하가 +2,
+3, +4 등 전하가 높기 때문에
충분히 m/z가 1,500이하로 떨어
져 분석할 수 있게 된다. ESI는
HPLC를 사용하여 직접 시료를
도입할 수 있는 장점이 있다.
ESI의 특징
• 전자 분사 이온화
• 액체 상태의 시료를 이온화(LC-MS)
• 기존의 방법으로는 얻기 힘들었던 intact 상
태의 peptide나 단백질을 이온화
• 한 개 이상의 전하를 띤 이온을 생성
Ion source : MALDI
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionizatio
n_maldi.html
• 분자량이 수천에서 수만에 이르는
극성 생화학 고분자 화합물
•1988년 독일과 일본
•MALDI 법은 매트릭스 물질과 분석
시료를 섞어 스테인리스 강 탐침 끝
에 바른다.
• 매트릭스는 레이저를 강하게 흡수
하며 그 후에 매트릭스와 분석물은
탈착되어 이온화된다.
•MALDI 법은 분석기로 비행 시간
(TOF)를 사용한다.
Ion source : MALDI
Laser
Sample
support
+
m m a+
m a
a
m+ m m
+
a m a
m +
a
m m
1. Matrix와 sample을 약
1000~10000:1로 섞어서 적당한
유기 용매에 혼합
matrix +
analyte
2. 혼합물을 시료용 plate에 올려놓고
진공 조건 만들어주면 유기 용매
는 기화되고 시료는 matrix와 함께
균질하게 결정화 된다.
3. 이 때 laser조사하면 에너지가
matrix를 통해 sample로 전달되어
약한 이온화가 일어난다.
4. 전기장을 사용해서 이온들을 모으
고 m/z에 따라 나누어 분석한다.
Laser
Sample plate
hn
1. Sample (A) is mixed
with excess matrix (M)
and dried
on a MALDI plate.
2. Laser flash ionizes
matrix molecules.
AH+
3. Sample molecules are
ionized by proton
transfer from matrix:
MH+ + A M + AH+.
+20 kV
Variable Ground
Grid
Grid
The Mass Analyzer: TOF
Time Of Flight(TOF)
Ion Source
20-25 kV
Flight Tube
+ +
The Mass Analyzer: TOF
Ion Source
Flight Tube
+
Detector
+
+
The Mass Analyzer: TOF
Ion Source
Flight Tube
+
+
Detector
+
MALDI ion
source
Ion
detector
The reflector focuses ion of same
mass but different velocity on
detector; high resolution is obtained
Ion reflector
HiRes mass spectrum
MALDI TOF의 특징
• 큰 분자량 물질을 분석 가능 (>400kDa)
• 혼합물 분석 가능
• 미량 분석 가능(펩타이드의 경우 fmol 분
석 가능)
• 데이터 분석 용이
• 염의 영향 덜 받음
• 비용 저렴, 빠른 시간 내에 가능
• 높은 throughput (>1000 sample/hour)
MALDI/TOF Mass spectrum
Calibration of the mass scale
The mass-to-charge ratio of an ion is proportional to the
square of its time of flight in the analyzer (“drift time”).
2
m 2t K
2
z
L
The Mass Analyzer: Quadrupole
The Mass Analyzer: Quadrupole
The Mass Analyzer: Quadrupole
Quadrupole(Mass filter)
- 4개의 금속 막대로 이루어져 있으며, 한쌍(1,2)은 DC
voltage, 다른 한 쌍(3,4)은 Radio frequency voltage가 가해
진다.
- Quadrupole의 막대는 각각 (+)와 (-)의 서로 반대되는 전하
를 가진다.
- 가해지는 전압의 진폭은 선택된 m/z에 해당되는 ion만 ion
source에서 detector까지 통과하게 한다.
- Quadropole의 전압을 바꾸면서 주어진 mass범위의 이온을
scanning 한다.
Detectors : MCP
MCP: Multiple-channel plate
Ions are detected with a Microchannel Plate
처음 들어온 primary
incident particle이 surface
를 치거나, some material을
통과하게 되면 secondary
particle의 방출이 유도된다.
-1000 V
-100 V
D= 6-25 u
+
Primary Ion from
Flight Tube
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-1000 V
-100 V
+
D= 6-25 u
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-1000 V
-100 V
D= 6-25 u
Multification by secondary emission
+
e-
Secondary emissive materials:
Beryllium oxide, magnesium oxide etc
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-1000 V
-100 V
D= 6-25 u
ee- e-
+
e-
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-1000 V
-100 V
D= 6-25 u
ee- e-
+
e-
L
Ions are detected with a Microchannel Plate
-100 V
D= 6-25 u
eee-
e-
e- e-
e-
eee- e
e-
+
Secondary particle이 여기서와
같은 electron일 때 이것을
secondary electron emission
이라고 한다.
-1000 V
~103
Amplification
L
Tandem MS(MS/MS)
MS/MS : MS를 두 번 사용하는 방법
Tandem MS(MS/MS)
MS/MS : MS를 두 번 사용하는 방법
CID : collision induce dissociation – 1차적으로 생성된 이온이 collision cell
에서 가스 분자와 충돌하면 fragmentation이 발생한다.
Peptide Mass Fingerprinting
• 단백질을 sequencing하는 분석 방법
• Protease를 사용하여 peptide를 잘게 쪼갠다.
• 절단 후 발생하는 단편들을 질량 분석을 통하
여 분석한다.
• Mass measured with MALDI-TOF
and ESI-TOF
Peptide Mass Fingerprinting
• 분석 가능 장비 : Q-TOF, MALDI-TOF, ESI MS
Peptide Mass Fingerprinting
Peptide Mass Fingerprinting
Thank you!!
*