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9장 뼈조직의 표본제작
(Bone tissue preparation)
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학습목표
1. 뼈조직의 구성에 대해 설명
2. 뼈조직 표본제작방법의 종류를 열거
3. 뼈조직의 검사 목적
4. 비정상적인 칼슘침착의 예.
5. 탈회의 의의.
6. 탈회제의 종류 및 그 특성을 설명.
7. 탈회방법들의 탈회기전과 장단점.
8. 탈회 촉진 방법
9. 과탈회와 미탈회 조직의 영향
10. 박절시 파라핀포매조직 내에서 석회화된 부위가 나타났다면 어떻게 처리
11. 산탈회 방법
12. 산탈회시 주의사항
13. 탈회완료 여부를 확인하는 방법
14. 칼슘의 염색방법과 그 염색기전
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뼈조직의 기능과 구성
골격의 주된 요소: 대사기능-칼슘, 인산염, 이온의 저장
기계적 기능-근육을 지지, 기관보호
조혈기능-골수
1. 뼈기질- 석회화된 세포사이질, 유기질(30~35%), 무기질(60~70%)
2. 뼈구성세포
1) 뼈모세포(osteoblast): 기질의 유기성분을 합성
2) 뼈세포(osteocyte): 뼈소강내에 존재
3) 뼈파괴세포(osteoclast): 뼈조직의 흡수와 재구성에 관여
넙다리뼈(femoral bone).
머리(head), 목(neck), 상부 뼈몸통(upper diaphysis)의 세로단면 사진
. 뼈의 구조
A. 치밀뼈 모형도. B. HE염색. C. 편광현미경사진. 많은 하버스관을 포함한 정상
치밀뼈(cortical bone)의 가로단면. 동심원상 층판(concentric lamellae)이 명확히
관찰되며(a), 몇 개의 간질층판(interstitial lamellae)(b)도 보인다. 편광현미경사진.
. 뼈잔기둥(bone trabecula).
C. 파골세포
B. 뼈세포,
A. 뼈모세포
A. 뼈모세포, B. 뼈세포, C. 파골세포
골육종환자의 긴뼈생검
A. 생검검체 B. X-선사진 C. HE염색표본
. 뼈생검조직 채취기구
A. 뼈 천공기(trephine), B. 천공기를 이용하여 채취한 생검 검체
1. 뼈기질(Bone matrix)
구성 : 유기질(30~35%) + 무기질(60~70%)
유기질 : 제 I형 아교섬유
무형기질(glycosaminoglycan)
무기질 : 인산칼슘(calcium phosphate)= 85%
탄산칼슘(calcium carbonate)
나트륨, 칼륨, 마그네슘 등
2. 뼈구성세포
1) 뼈모세포(Osteoblast)
기능 : 뼈기질의 유기성분 (제 I형 아교섬유, proteoglycan)
당단백질 합성
무기질 침착
풋뼈조직(Osteoid tissue) : 뼈모세포에서 새롭게 합성되어 세포주위로
분비된 아직 석회화되지 않은 기질
구루병(rickets), 골연화증 때 증가
2) 뼈세포(osteocyte)
정의 : 뼈기질에 의해 둘러싸여 있는 뼈모세포
위치 : 뼈기질의 층판구조(lamellae)사이에 있는 뼈소강(lacunae)
3) 뼈파괴세포(osteoclast)
위치 : 뼈흡수가 일어나고 있는 뼈에서 기질이 효소에 의해 침식되어
함몰된 부위인 침식소강(Howship’s lacunae)내에 위치
기능 : 산과 아교질분해효소(collagenase) 및 다른 단백질분해효소를
분비하여 뼈기질을 파괴하며, 석회화된 무형기질을 유리
뼈 조직(Bone tissue)
◈ 뼈구성세포
T: 뼈지주 (bony trabecula)
PO: 골막 (periosteum)
OB: 뼈모세포 (osteoblast)
BM: 골수 (bone marrow)
◈ 뼈구성세포
OB: 뼈모세포 (osteoblast)
MX: 뼈기질 (bony matrix)
OC: 뼈파괴세포 (osteoclast)
LC: 뼈소강 (lacuna)
HP: 조혈세포 (hemopoietic cells)
BM: 골수 (bone marrow)
뼈의 종류 및 검체의 종류
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치밀뼈: 빈공간이 없다
해면뼈: 공간이 많다
일차뼈(primary bone)또는 세망섬유성 막뼈(woven bone):
아교섬유다발이 여러방향으로 배열
이차뼈(secondary bone)또는 층판뼈(lamellar bone): 뼈층판을 따라 배열
뼈검체의 종류
1. 생검검체-종양 또는 감염의 진단을 위한 검체
대사성 뼈질환의 진단을 위한 검체
2. 절단검체-종양, 만성 골수질환, 괴저
3. 절제검체-양성종양, 저등급의 악성종양 및 넙다리뼈머리부위에 관절염
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접수.육안관찰
파라핀절편 제작 단계
고
정
수 세
탈 회
중 화
뼈조직 진단을 위한 표본제작과정의 흐름도
뼈조직 처리단계
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조직의 선정: 전기톱으로 4~5mm 두께로 절취
고정: 10% formalin(일반적), 골수조직(Bouin`s)
탈회: 탈회액으로 처리하여 조직내 킬슘제거
중화: 무기산을 사용하여 탈회시킨 조직은 알카리 용액으로 중화
수세: 조직내 산과 알카리성분을 제거
수세가 완료된 조직은 부드러운 조직과 동일하게 파라핀포매 과정을 시작한다.
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인체에서 가장 단단한 조직: 이(Tooth), 뼈(Bone)
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Calcium: Ca++
Calcification: 석회화-조직에 칼슘염이 침착
Decalcification: 조직에서 인위적으로 칼슘염을 제거하는 과정
탈회제의 종류
◈ 산 탈회제
원리 : 뼈조직내 인산 또는 탄산과 같은 음이온과 결합되어 있는 칼슘이
산과 반응하여 용해성 칼슘염을 형성하여 제거
무기산 이용 - 염산, 초산, 질산, 황산, formic acid, Nitric acid 등
CaPO4 --→ Ca＋2 + 2Cl－ --→ CaCl2 ↓(침전)
↑
H++Cl－
① 질산(Nitric acid, HNO3): 5~10%의 질산수용액
5% 이하이면 결합조직이 팽창, 10% 이상이면 염색성 손상
매일 교환 또는 1% 요소(urea)첨가하여 아질산형성을 억제
탈회가 끝나면 0.25% 탄산리튬으로 처리(조직팽창을 억제)
② 포름산(formic acid, HCOOH): 5~10% 포름산수용액
탈회가 끝나면 0.25% 탄산리튬으로 처리(조직팽창을 억제)
③ 프랑크-리클로(Plank-Rychlo)용액
: 염화알루미늄 7g + 농염산 8.5ml + 90% 포름산 5ml + 증류수 10ml
5% 질산수용액의 3배의 빠른 탈회
탈회가 끝나면 5% 황산나트륨으로 처리(조직팽창을 억제)
④ 포름산-구연산나트륨(formic acid-sodium citrate)용액
: 1액(90% formic acid 50ml + 증류수 50ml)
2액(sodium citrate 20g + 증류수 100ml) 동량 혼합
5% 질산수용액에 3배정도 느린 탈회속도
결합조직의 팽창이 거의 발생하지 않는다.
◈ 조직화학적 염색을 위한 탈회제
목 적: 효소를 비롯한 산탈회제에 파괴될 수 있는 화학성분(=핵산)의 검출
조직에 대한 상해가 적고 구조 및 염색성 보존이 우수
탈회속도가 느림
① EDTA 2Na(Disodium ethylendiamine tetraacetate)
EDTA는 칼슘 등과 같은 금속이온들과 킬레이트를 형성하여 탈회
14% 수용액 pH 7.4~7.5로 조절
작은 뼈침(Bone spicules): 1주일, 치밀골 : 6~8주
② 마그네슘-구연산(Magnesium-citrate)용액
pH 7.0~7.6, 갈비뼈 : 15일 소요, 용액은 3일마다 교환
◈ 일반 산 탈회방법
방법: 조직편을 거즈로 싸서 탈회용기 바닥에 밀착되지 않도록 실로 메달아
탈회, 조직 부피의 10~20배의 탈회액
속도: 온도가 상승하면 증가(적정 온도: 10~30℃)
온도가 낮아지면 지연
0℃에서는 탈회가 되지 않는다.
◈ 일반 산 탈회방법(10% Formic acid)
12Hr Formic acid 탈회사진
48Hr Formic acid 탈회사진
◈ 특수 산 탈회방법
(1) 초음파 탈회법: 초음파 발생기(Ultrasonic generator)를 사용하여 탈회
7.5% 아세트산(acetic acid)탈회액에 1초당 10,250사이클의 주파수를 발생
단 점 : 탈회액의 온도 상승(56℃)
(2) 극초단파 탈회법
(3) 이온교환수지 탈회법: 양이온교환수지(cationic exchange resin)를 이용,
탈회액 내에 유리된 칼슘이온을 신속히 제거
탈회액 - 10~20% 포름산(fromic acid)
양이온교환수지– 탈회액 80~90ml 당 10g
(4) 전기분해 탈회법: 전기분해(electrolysis)에 의해 뼈조직내 칼슘이
이온화를 증진시켜 신속한 탈회
원 리: 양극(anode)에 전기를 통전하여 칼슘이온이 음극(cathod)으로 이동시키는
힘을 이용
전해질 용액: 8% 염산(HCl) + 10% 포름산(formic acid) 동량
탈회온도 : 30~45℃, 모든 뼈조직 : 2~6시간
(5) 표면 탈회법(surface decalcification)
방 법 : 블록 상태로 조직이 노출된 표면을 직접 탈회액에 담가 칼슘을
제거, 탈회액(1% 염산/70% 에탄올 or 10% formic acid)을 적신
거즈패드나 스폰지를 직접 파라핀 블록표면에 접촉
단 점 : 조직표면으로 부터 몇 장의 절편만 박절가능
탈회종료의 확인
물리적 검사-칼로 조직을 잘라본다. 바늘로 조직을 찔러본다
(1) 화학적 검사
① 수산칼슘검사(Calcium oxalate test)
1단계 – 탈회액 내에 녹아 나온 칼슘이온의 양이 많으면 강암모니아수를 떨어
뜨릴 때 수산칼슘(Ca(OH)2)이 형성되어 침전
2단계 – 1단계에서 침전물이 없으면 수산암모늄포화수용액을 첨가하여
수산칼슘(Calcium oxalate) 형태의 흰색 침전물발생 여부 관찰
3단계 – 30분 이상 투명한 상태를 유지하면 탈회 종료판정
A : 칼슘이온이 남아 있으면 흰색 침전물이 발생
B : 칼슘이온이 더 이상 탈회액내에 존재하지 않으면 투명
물리적 탈회 확인 방법
손을 사용하여 구부려(A) 보거나 칼로 잘라서(B) 탈회 유무를 확인한다
② 이산화탄소 기포검사(CO2, bubbles test): 산탈회 진행과정에서 발생된
이산화탄소(carbon dioxide)가 조직의 표면에 기포층을 형성
주기적으로 흔들어 조직표면의 기포 층이 없어진 후 다시 기포가 생기지 않는
시점을 탈회 종료 시점
단 점 : 무기염류의 10%에 해당하는 탄산칼슘만이 질산과 반응하여
Co2가스가 발생하므로 정밀한 검사법으로는 부적당
(2) 방사선촬영 검사
: 현미방사선 연구에 사용하는 연성 X-선 발생장치를 이용
탈회 종료 검사 중 가장 확실한 검사법
판 정: 탈회가 안된 부분은 비투과성, 탈회된 부분은 반투과성
탈회부분: 반투과성
비탈회부분 : 비투과성
비탈회뼈조직의 표본제작
◈ 목 적 : 뼈무기질의 검출이나 무기질과 비무기질 성분과의 상호 관련성
1) 연마법(grinding method):
탈회를 할 수 없는 뼈조직에 자주 적용되는 방법
고정된 뼈조직으로 만든 연마절편(40~100㎛)- 유기물질 검출
신선 뼈조직의 연마 절편 – 각종 효소활성의 검출
LC: 뼈소강 (lacuna) HS: 하버스계 (Haversian system) HC: 하버스관 (Haversian canal)
피질뼈의 연마절편(ground sections)
2) 접착 테이프법(adhesive tape methods): 비탈회 뼈조직의
이중포매블록을 박절하는 동안 절편을 잘 유지시키기 위해 사용
3) 특수 박절법: 뼈조직 자체를 그대로 기계적으로 박절
4) 현미방사선 촬영법(Microradiography): 뼈무기질의 밀도와 분포의 검사
골종양의 병리학적 분류
골모세포종(osteoblastoma)
Femoral head
Central tumor of giant cell
표면탈회 방법
페트리접시에 탈회액을 채운 후 거즈에 스며들게 한 후 그 위에 블록을 접촉
시켜 탈회하는 방법.