Transcript 20141027 생명과학실험기법 GOT GPT (1) (85918)

효소를 이용한 간 기능 검사
실험 목적
GOT • GPT를 이용한 간 기능 검사
생체에서 단백질 합성, 포도당 및 탄수화물 대사, 핵산 대사,
지질 대사, 약물 대사 등을 담당하는 중요한 기간인 간은 여
러 질환들로 인해 손상 될 수 있다.
간 손상을 정확히 진단하기 위해 효소를 이용한 생화학적 방
법들을 통하여 간 기능 검사를 진행하여 본다.
주요 검사로는 AST(GOT), ALT(GPT) 등이 있다.
Introduction
•
GOT • GPT
Aminotransferase(transaminase)의 활성 측정
: aminotransferase는 keto acid와 amino acid 간 amino 기의 교환을 촉매하는 효소
① AST(aspartate aminotransferase) = GOT (glutamic oxaloacetic transaminase)
② ALT(alanine aminotransferase) = GPT (glutamic pyruvate transaminase)
•
간세포 내에 존재하는 효소들로 주로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중
으로 방출되어 혈중 수치가 증가하게 된다. 급성 간세포 손상 초기에는
간 세포 내 농도가 높은 AST가 ALT보다 더 많이 증가하지만 24~48시간
뒤에는 반감기가 긴 ALT가 더 높아진다. 알코올성 간염에서는 AST가 더
증가하고, 만성 간세포 손상에서는 ALT가 더 높다.
Introduction
AST(=GOT)
1.
Aspartate + α-ketoglutarate → glutamate + oxaloacetate
2.
oxaloacetate + dinitrophenylhydrazine → hydrazone
3.
생성된 colored hydrazone을 spectrophotometer로 측정
ALT(=GPT)
1.
Alanine + α-ketoglutarate → glutamic acid + pyruvate
2.
pyruvate + dinitrophenylhydrazine → hydrazone
3.
생성된 colored hydrazone을 spectrophotometer로 측정
GOT • GPT
Materials & Methods
GOT • GPT
GOT용 기질액, GPT용 기질액, NaOH, 정색시약, 검량선용 시약,
마우스 혈청, water bath, spectrophotometer, vortex mixer
▶ 표준곡선 작성
1. 시험관 번호 1~5의 순서대로 검량용 시약을 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4ml씩 분주한다.
2. GOT 기질액 또는 GPT 기질액을 순서대로 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6ml씩 분주한다.
3. 각각의 시험관에 증류수 0.2ml, 정색시약 1ml씩 분주한다.
4. 0.4N NaOH를 10ml씩 분주하여 잘 혼합한 후 실온에서 10분간 방치한다.
5. 증류수를 대조로 하여 spectrophotometer의 파장 505nm에서 흡광도를 측정한다.
6. Transaminase 활성치의 단위를 X축, 흡광도를 Y축으로 하고 각각의 흡광도 실측
치와 그에 해당하는 transaminase 단위와의 대응점을 연결하여 GOT 및 GPT용 표준
곡선을 작성한다.
Materials & Methods
GOT • GPT
GOT용 기질액, GPT용 기질액, NaOH, 정색시약, 검량선용 시약,
마우스 혈청, water bath, spectrophotometer, vortex mixer
▶ 시료 측정 작성
1. GOT/GPT 기질액 각 1ml을 37℃ waterbath에서 5분간 가온한다.
2. 마우스 혈청 10ul를 각 기질액에 섞어 37℃ waterbath에서 GOT는 60분,
GPT는 30분간 가온한다.
3. 정색시약 1ml과 잘 혼합한 후 실온에서 20분간 방치한다.
4. 0.4N NaOH 10ml과 혼합한 후 실온에서 10분간 방치한다.
5. 증류수를 대조로 하여 spectrophotometer의 파장 505nm에서 흡광도를 측정한다.
Materials & Methods
GOT • GPT
GOT용 기질액, GPT용 기질액, NaOH, 정색시약, 검량선용 시약,
마우스 혈청, water bath, spectrophotometer, vortex mixer
▶ 측정상의 주의 사항
1. 0.4N NaOH 10ml을 넣을 때는 5초 이내에 분주할 수 있는 구멍이 큰 것을 사용
한다.  Serological pipet & pipet aid 이용
2. 혈청을 넣을 때는 정확도가 높은 마이크로 파이펫을 사용한다.
3. 효소 반응의 온도 및 시간을 정확히 취한다.
4. 표준 곡선에서 벗어나는 높은 치를 나타내는 혈청에 대해서는 생리식염수로 정확
히 희석하여 얻은 측정치에 희석배수를 곱하여 준다.
기질액
(GOT/GPT)
1ml
혈청
10ul
정색시약
1ml
0.4N NaOH
10ml
60분 이내에
37℃
37℃
실온
혼합
505nm(490~530nm)
5분
GOT : 60분
GPT : 30분
20분
실온 10분
증류수를 대조로
파장에서
흡광도 측정
Results
GOT • GPT
측정한 시료의 흡광도를 표준곡선에 대입하여 구해보고, 나온
값이 정상치인지 확인한다.
정상치
GOT : 8~40 karmen 단위
GPT : 5~30 karmen 단위