Transcript 미생물 분자유전검사실 정도관리 경험 및 실제

미생물 분자유전검사의
정도관리
: HCV PCR과 결핵균 PCR을 중심으로
서울대학교병원 주 세 익
검체접수
결과보고
?
결과판독
검정
?
?
검체보관
?
?
?
?
PCR 반응
PCR 검사과정: 정도관리의 不安 ?
핵산추출
?
핵산보관
표 1. 결핵균 DNA 추출과 HCV RNA 추출
1999년
참여(%)
DNA 추출법
2001년
오류
참여(%)
53 기관
38 기관
Kit, diagnostic use
17(44.7)
Kit, research use
10(26.3)
14(26.4)
Home-made
11(28.9)
13(24.5)
RNA 추출법
14(38.9)
Kit, research use
16(44.4)
Home-made
1
6(16.7)
26(49.1)
2
24(58.5)
2
14(34.1)
4
3( 7.3)
1
나는 항상 핵산 추출에 성공하고 있는가?
국내정도관리결과 : 핵산추출법
2
41 기관
36 기관
Kit, diagnostic use
오류
표 2. 결핵균 PCR과 HCV RT-PCR 결과
1999년
참여(%)
결핵균 PCR
Kit, diagnostic use
Kit, research use
Home-made
HCV RT-PCR
Kit, diagnostic use
Kit, research use
Home-made
2001년
오류
오류
51 기관
37 기관
16(43.2)
참여(%)
1
25(49.0)
8(21.6)
18(35.3)
13(35.1)
8(15.7)
2
41 기관
36 기관
14(38.9)
24(58.5)
2
9(25.0)
1
11(26.8)
2
13(36.1)
1
6(13.6)
3
나는 항상 보고하는 결과를 확신하는가?
국내정도관리결과 : 검사방법
? 검체 운송상태가 결과에 얼마나 영향을 미칠까?
 원내 운송의 경우는 실온 운반
? 퇴근시간인데 검체를 어떻게 보관해야 좋을까?
 결핵균 검체는 냉장보관
 HCV 검체는 혈장분리하여 0.1% sodium azide 첨가, 냉장
? 결핵균 집균을 가장 효율적으로 하려면?
 1% DTT로 동량 첨가하여 37ºC에 10분, 원심분리
? HCV 검체로 혈청검체는 좋은가?
 혈장 검체보다 HCV가 감소함.
검체처리과정의 의문과 확신
? 핵산추출의 성공여부를 즉시 알 수 있을까?
 결핵균 검체에는 반드시 환자 자신의 세포가 있음 : 전기영동
 HCV 검체에 carrier DNA(RNA)을 일정량 첨가하여
핵산 추출 후 spectrophotometer로 정량 : 회수율 평가
? 핵산을 어떻게 보관해야 좋을까?
 DNA는 1x TE에 녹여 냉장보관, -70ºC에 보관
 RNA는 RNA침전물의 단계에서 75% EtOH-1 mM EDTA에
녹여서 -70ºC에 보관.
Column 법으로 추출할 경우는 Rnase-free water로 녹여
-70ºC에 보관.
핵산추출과정의 의문과 확신
2~5 cycles
90
95ºC
95ºC
95ºC
5 min
1 min
30 sec
70
50
30
25~30 cycles
72ºC
72ºC
72ºC
1 min
30 sec
5 min
55ºC
55ºC
1 min
30 sec
Initial
denaturation
PCR 과정의 이해 : temperature cycle
Final
extension
PCR반응의 구
성 성분
일반적
시약 농도
혼합액 조성 시
사용량
PCR 반응액 내
최종 분자수
DNA template
100 ng/l
3-5 l
105~106 분자수
Taq DNA pol
5 U/l
0.1~0.3 l
1010~1011 분자수
Primers
10~20 pmol/l
1~2 l
1012~1013 분자수
Mg+2
25 mM
1~4 l
1015 분자수
dNTPs
10 mM
1~2 l
1015~1016 분자수
PCR products
PCR 과정의 이해 : 반응액 내의 분자들
1011~1012 분자수
증폭량, 10n
Plateau phase
6
5
4
3
2
Initiation phase
10
20
30
반응회수
PCR 과정의 이해 : 증폭산물의 증가
PCR이 잘 된 것 같으니
결과를 믿을 수 있다?
?
(어떤 검사실의 DNA PCR 증폭산물의 전기영동)
PCR 산물의 분석(1) : 양성? 음성?
PCR이 잘 안된 것 같으니
결과를 믿을 수 없다?
?
? 결과에 확신을 가질 수 있는 방법은 없을까?
 최저 예민도를 표현할 수 있는 CONTROL을 사용
PCR 산물의 분석(2) : 양성? 음성?
검체별 PCR 반응의 차이가 있
지는 않을까?
Internal control을 사용하여 각
반응의 동일성을 확인하다 !
(강남성모병원의 결핵균 PCR 자료 인용)
PCR 산물의 분석(3) : 반응의 동일성 확인
비특이적인 bands는 아니겠지?
(size가 같은 것 같아…)
증폭산물의 내부에 존재하는
제한효소로 처리하여 확인
PCR 산물의 검증(1) : 제한효소처리
증폭산물의 내부에
결합하는 probe로 확
인
PCR 산물의 검증(2) : Hybridization
그림 1. 양성대조검체의 연도별 흡광도 변화 (서울대병원)
검사
회수
CV(%)
60
65
50
47.3%
59
40
30
60
61
54
40
28.2%
25.3%
20
22.7%
20
10
숙련도가 중요하다.
결론(1) : 숙련되어야 한다.
각 검사법의 예민도를 측정하여야 한다.
 결핵균 집락 10개에 대한 계단희석 검체를 이용한 검사
 HCV Ab(+) fool serum의 계단희석 검체를 이용한 검사
 반드시 10회 이상 반복검사에서 항상 양성을 확인할 수
있는 최대 희석검체를 양성 대조검체로 사용한다.
결론(2) : 최저 측정지의 양성대조를 사용
가능한 internal control을 사용한다
 핵산 추출의 실패를 확인할 수 있다.
 PCR 반응의 성공여부를 확인할 수 있다.
증폭산물의 검증은 필수
 제한효소로 소화되는지 확인한다.
 Hybridization을 실시한다.
결론(3)
분자유전검사 키트의 유효성 평가기준 마련
새로이 개발되는 국내 바이오 벤처사의 제품들이
진단 유효성에 대한 제대로 된 평가 없이
임상에 적용되고 있음.
이들에 대한 유효성 평가 기준을 마련하는 것이 시급함.