Transcript การตรวจวินิจฉัยโรคลิชมาเนีย

การตรวจวินิจฉัยโรคลิชมาเนีย โดย สวาท ชลพล
1. ทางคลินิกClinical diagnosis
สอบประวัติ ดูตามผิวหนังรอยถูกริ้นฝอยทรายกัด ตุ่ม แผลหายยาก(CL)
อาการไข้ หนาวสั่ น เลือดออกตามไรฟัน ตับม้ ามโต(VL)
2. ตรวจซีรั่มให้ ผลบวกต่ อเชื้อฯ(Serological diagnosis:Antibogy)
หรือ Antigen)
- Direct agglutination(DAT)
- Indirect fluorescent antibody test(IFAT)
- Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)
- Complement fixation test(CFT)
- Indirect haemagglutination test (IHA)
- Latex agglutination
- Dipstick rK39 Ag.
- Western-blot analysis
ฯลฯ
3. ตัวเชื้อโรค(Parasitological diagnosis)
ตรวจหา amastigote
- ย้ อมสี (Stained smear)
- ฉีดเข้ าสั ตว์ ทดลอง(Animal inoculation)
- เพาะเลีย้ งเชื้อ(Culture)
4. ระดับโมเลกุล(Molecular diagnosis)
หา DNA เช่ น PCR ซึ่งนิยมใช้ อย่ างแพร่ หลาย
และใช้ แยกชนิดเชื้อลิชมาเนีย
การตรวจวินิจฉัยCutaneous leishmaniasis
ด้ วยกล้ องจุลทรรศน์
ตุ่ม พองใส
แผลเปี ยก/แห้ ง
ตุ่มพองใส
ใช้ ใบมีด(blade) กรีดเป็ นแผลเล็กน้ อย เขี่ย/ขูดเนือ้
เยือ่ หรือดูดนา้ เหลืองก้ นแผล
: ขูดนา้ เหลืองหรือเนือ้ เยือ่ ก้นแผล
: เข็มเบอร์ 20 แทงผิวหนังข้ างแผล ดูดนา้ เหลืองทีก่ ้ นแผล
เกลีย่ บนสไลด์ ย้ อมสี ยมิ ซ่ าตรวจหา amasigote
กาลังขยาย 100x
ศตม./นคม./สอ./อปท. ดาเนินการในภาคสนามได้
กลุ่มเป้ าหมายทีค่ วรสารวจ CL
• คนไทยในพืน
้ ที่มีปัจจัยเสี่ ยง
• แรงงานไทยกลับจากประเทศที่เป็ น
แหล่งแพร่ โรค
• แรงงานพม่ า
•มุสลิมทีก่ ลับจากร่ วมพิธีฮัจจ์
การตรวจวินิจฉัยโรคริชมาเนียด้ วย
DipstickTest โดย สวาท ชลพล
-เป็ นโรคติดต่ อที่เกิดจากโปรตัวซัว(สั ตว์ เซลเดียว)ใน
สกุลริชมาเนีย
-อยู่ในเซลล์ เม็ดเลือดขาวของสั ตวเลีย้ งลูกด้ วยนมหลาย
ชนิด
-ติดต่ อระหว่ างสั ตว์ กบั คนโดยผ่ านการถูกแมลงริ้นฝอย
ทรายกัด
-เชื้อโรคเมื่ออยู่ในคนสามารถก่ อให้ เกิดโรคอาจทาให้ ถึง
ตาย
-แต่ อยู่ ในสั ตว์ ไม่ แสดงอาการของโรคเป็ นสั ตว์ รังโรค
(Carrier) สั ตว์ รังโรคเป็ นสั ตว์ กดั แทะจาพวก
กระรอก กระแต gerbils และสุ นัข
เป็ นโรคของสั ตว์ แต่ แพร่ สู่ คนได้
(zoonosis)
เชื้อ leishmaniaในคน แบ่งเป็ น 3 ชนิด
• 1.ก่ อให้ เกิดแผลทีผ่ วิ หนัง เช่ น แขน ขา
Cutaneous leishmaniais:CL :ชนิด
เชื้อ L.aethiopica, L.mexicana
complex
• 2.ก่ อให้ เกิดแผลตามปากและจมูก
Mucocutaneous
leishmaniais:ML ชนิดเชื้อ
L.brazilliensis complex)
• 3.ก่ อให้ เกิดพยาธิอวัยวะภายใน ตับ ม้ าม อักเสบ บวมโต
Visceral leishmaniasis:VL :ชนิดเชื้อ
L.donovani complex,
L.d.infantum, L.d.chagasi ในไทย พบ
L.donovani และ L.d.infantum ส่ วนเชื้อ
ชนิดใหม่ อย่ รู ะหว่ างตั้งชื่อว่ า L.siamensis
การตรวจและวินิจฉัยโรคริชมาเนีย
• 1. แผลตามผิวหนังและเยือ่ บุ โดยวิธี
• 1.1 Clinical Diagnosis ตรวจดู
แผลตามร่ างกาย ดูต่ ุมพองใส หรือ แผล
(sore)มักมีขนาดใหญ่ ขอบนูนแข็ง ตรง
กลางแผลอาจแห้ งหรือเป็ นหนองมีนา้ เหลืองเยิม้
จานวนตุ่มหรือแผลขึน้ อยู่กบั จานวนครั้งทีถ่ ูก
กัดหรือระบบภูมคิ ุ้มกัน
• 1.2ตรวจหาเชื้อจากแผล(Parasitological
diagnosis) โดยขูดหรือตัดเนือ้ เยือ่ ก้นแผล
ป้ ายบนสไลด์ (smear)ทิง้ ไว้ ให้ แห้ งแล้ ว fixed
ด้ วย methanal และย้ อมด้ วยสี Giemsa
หรือ สี Wright ใช้ ตรวจหา amastigote
ในเม็ดเลือดขาว ตรวจด้ วยกล้ องจุลทรรศน์
กาลังขยาย 100x
• กรณีเป็ นตุ่มพองใส อาจใช้ เข็ม เบอร์ 20 แทง
และดูดเอานา้ เหลืองหรือใช้ มดี กรีดเปิ ดตุ่ม แล้ ว
ดูดนา้ เหลืองจากก้นแผลนาไปตรวจ
2.อวัยวะภายใน(ตับ ม้ าม)
• 2.1 ดูลกั ษณะภายนอกทัว่ ไป
–อ่ อนเพลีย ผอม ท้ องป่ อง หลอดเลือดดาโป่ งหน้ าท้ อง
ผิวหน้ าคลา้ บวมตามมือ เท้ า ตับโต ไข้ ค่อย ๆ เย็นขึน้ หรือ
อาจเป็ นกะทันหันและมักสะท้ านหรือสั่ นคล้ ายมาลาเรี ย
คลืน่ ไส้ อาเจียน อาจมีไข้ ขนึ้ วันละ 2 ครั้ง ไข้ สูงนายหลาย
สั ปดาห์ (ไข้ เรื้อรัง) เหงือ่ ซึม ปวดตามข้ อ กระดูก และ
กล้ ามเนือ้ โลหิตจาง นับจานวนเม็ดเลือดขาวตา่ กว่ า 2,000
ต่ อลูกบาศก์ มลิ ลิเมตร
–อาจมีไข้ ขนึ้ วันละ 2 ครั้ง ไข้ สูงนานหลายสั ปดาห์ (ไข้
เรื้อรัง) เหงือ่ ซึม ปวดตามข้ อ กระดูก และกล้ ามเนือ้
โลหิตจาง นับจานวนเม็ดเลือดขาวต่ากว่ า 2,000 ต่ อ
ลูกบาศก์ มิลลิเมตร
• ชาย/หญิง ปกติ ประมาณ 5,000-10,000 Cell/ลบ.มม.
ส่ วนเด็ก 10,000-12,000 Cell
2 .2 ตรวจทางนา้ เหลือง (Serological
diagnosis)
•
คนไข้ มักมี IgG ในนา้ เหลืองสู ง สามารถตรวจได้
ง่ าย มีความไวและความจาเพาะสู ง เหมาะต่ อการใช้
ตรวจหาโรคในกลุ่มคนทีเ่ สี่ ยงต่ อการเกิดโรค วิธีที่
นิยมคือ ELISA dot – ELISA,
IFAT, DAT, Formal – gel
reaction (ปัจจุบันไม่ นิยมใช้ กนั แล้ ว)
• 2.3 ตรวจหาเชื้อฯ จากอวัยวะภายใน
•
โดยเจาะไขกระดูก (bone
marrow) หรือดูดของเหลวจากตับ ม้ าม
ต่ อมนา้ เหลือง ป้ายบนสไลด์ นาไปย้ อมสี และ
ตรวจหา amastigote ด้ วยกล้องจุลทรรศน์
แต่ วธิ ีนีต้ รวจพบเชื้อได้ ยากในระยะแรก ๆ ของการ
ติดเชื้อ
• เกิดจากที่ริ้นฝอยทรายเพศเมียที่มีเชื้อโปรโตซัวในสกุล ลิชมา
เนีย (Leishmania spp.) ที่มีเชื้ออยูใ่ นน้ าลายตามปาก
ดูดและทางเดินอาหาร กัดดูดเลือดของสัตว์หรื อมนุษย์เพื่อการ
วางไข่ ลักษณะเหมือนการดารงชีพของยุง ชอบกัดนอกบ้าน ริ้ น
ฝอยทรายจะอาศัยอยูใ่ นบริ เวณที่ที่มีความชื้น มืดครึ้ ม ทารังอยู่
ตามพื้นดิน ไม้ผุ จอมปลวกเก่า ตามรอยแตกแยกของ
สิ่ งก่อสร้าง ปกติจะมีอายุเฉลี่ยประมาณ 60 วัน ออกหากิน
ตอนพลบค่าหรื อใกล้มืด ริ้ นฝอยจะบินในระดับต่ากว่าระดับ
เอว และหากินห่างจากรังของมันประมาณ100-300เมตร
เท่านั้น
• ยังมีการตรวจด้ วยวิธีอนื่ ๆ อีก อาทิ การ
เพาะเลีย้ งเชื้อในอาหาร (culture) กับการ
ฉีดเข้ าสั ตว์ ทดลอง (Animal
inoculation) แต่ วธิ ีเหล่านีค้ ่ อนข้ างใช้
เวลานาน เหมาะสมกับการสอนและศึกษาวิจัย
มากกว่ า
• วิธี PCR – based DNA มีความ
แม่นยาสูงสามารถใช้แยกชนิดเชื้อลิชมาเนียและ
ดูความหลากหลายของ strain เชื้อโรคได้
• ปัจจุบนั ได้มีเทคโนโลยีชุดตรวจวินิจฉัยอย่าง
รวดเร็ ว “rK39 Dipstick Test” ตรวจ
ซี รั่มผูป้ ่ วยที่มีพยาธิสภาพอวัยวะภายใน (VL)
หลายประเทศโดยเฉพาะประเทศที่เป็ นแหล่ง
แพร่ โรคได้ทดสอบประสิ ทธิภาพชุดตรวจนี้กบั
ผูป้ ่ วยและสัตว์รังโรค ปรากฏทั้งความไว และ
ความจาเพาะเป็ นร้อยละ 100 เท่ากัน
•ประเทศอินเดีย บังคลาเทศ และ
เนปาล ได้ ใช้ ชุดตรวจนีป้ ระเมินผล
การควบคุมโรคในโครงการกาจัดโรคลิ
ชมาเนียให้ หมดไปภายในปี 2015
ตามการลงนามร่ วมกันกับ WHO
• บางประเทศได้ ประยุกต์ rK39
dipstick ตรวจค้ นผู้ป่วย Visceral
leishmaniasis ที่ไม่ ปรากฏอาการ
เพือ่ ทานายแนวโน้ มการแพร่ ระบาดโรคลิ
ชมาเนียในแต่ ละพืน้ ที่
• ประเทศไทย ยังไม่ เคยนาเครื่องมือนีม้ าทดสอบ
และใช้ ตรวจค้ นหาผู้ป่วย Visceral
leishmaniasis ในที่นี้ จึงเป็ นเพียง
การเสนอคุณลักษณะของชุดตรวจ เพือ่
ประกอบการพิจารณาการดาเนินงานเฝ้ าระวัง
โรคลิชมาเนียในอนาคต
• ชุดตรวจอย่างรวดเร็ ว rK39 dipstick
test เป็ นเครื่ องมือใหม่ (New tool) ใช้
ตรวจหาผูป้ ่ วยโรค
• ลิชมาเนีย โดยเฉพาะผูท้ ี่เป็ น Visceral
leishmaniasis เครื่ องมือนี้ใช้ง่าย
สะดวก รวดเร็ ว และราคาไม่แพงมากเกินไป
เมื่อเปรี ยบเทียบกับวิธีอื่น ๆ ที่กล่าวมาข้างต้น
• dipstick test เป็ นแผ่นเยือ่ บาง
(membrane) ที่เคลือบด้วย
recombinant VL antibody
(rK 39) ตรงตาแหน่งทดสอบ (Test
:T) และ chicken anti – protein
A ที่ตาแหน่งควบคุม(Control :C)
• แผ่น dipstick test บรรจุในซอง
พลาสติกที่ปิดแน่นสนิท(sealed)
ภาพ 1
แผ่น rK39 dipstick Test
ภาพที่ 2
ซองพลาสติกที่ภายในบรรจุ dipstick
test 1 ชิ้น
ข้ อควรปฏิบัตแิ ละพึงระวัง(Precaution)ในการใช้
ชุดตรวจ dipstick test
• 1. ห้ ามใช้ ชุดตรวจฯ ทีห่ มดอายุค้นหาผู้มีเชื้อโรคลิ
ชมาเนีย
• 2.อ่ านรายละเอียดวิธีการใช้ ชุดตรวจในคู่มือให้ เข้ าใจ
และปฏิบัติตามขั้นตอนอย่ างเคร่ งครัด
• 3.สวมเสื้อผ้ าปกปิ ดส่ วนต่ างๆของร่ างกายมิดชิด
สวมถุงมือและแว่ นตา รวมทั้งล้ างมือทุกครั้งเมื่อ
เสร็จสิ้นการปฏิบัติงาน
• 4.หลีกเลีย่ งการให้ มือสั มผัสตาและเยือ่ บุบาง ๆ
• 5. ห้ ามรับประทาน ดืม่ หรือสู บบุหรี่ ระหว่ าง
ปฏิบัติงาน
• 6. ระมัดระวังอย่ าให้ นา้ ยา buffer โดน
ร่ างกาย
การเก็บรักษา dipstick test
•
ควรเก็บ dipstick testไว้ ในตู้เย็นที่
อุณหภูมิ 20-28ºซ (ไม่ เก็บในช่ องแข็ง) ส่ วนขวด
Chase buffer เก็บไว้ ทอี่ ณ
ุ หภูมิ 2-8º
ซ ทุกครั้งทีฉ่ ีกซองพลาสติกแล้ว ควรใช้
dipstick ตรวจซีรั่มผู้ป่วยภายใน 1 ชม.
การเก็บตัวอย่ างซีรั่ม
• 1. dipstick test ใช้ ตรวจเฉพาะกับ
ซีรั่มเท่ านั้น ไม่ ใช่ เลือดโดยตรง
• 2. เก็บซีรั่มอย่ างรวดเร็วหลังจากแยกส่ วนกับ
เซลเม็ดเลือดแดง กรณีเม็ดเลือดแดงแตก
(hemolysis) จะทาให้ การตรวจวินิจฉัย
คลาดเคลือ่ นได้
• 3. ควรตรวจซีรั่มหลังจากแยกเก็บจากเซลเม็ด
เลือดแดงทันที กรณีไม่ อาจทาได้ สามารถเก็บไว้
ในตู้แช่ แข็งอุณหภูมิ 2-8º ซ ไม่ เกิน 3 วัน และ
ก่อนทดสอบ ต้ องละลายความเย็นให้ หมดโดย
วางทิง้ ไว้ ทอี่ ณ
ุ หภูมหิ ้ อง หลังใช้ ทดสอบกับชุด
ตรวจแล้วต้ องทิง้ ไม่ ควรเก็บซีรั่มแช่ แข็งซ้า
ขั้นตอนการใช้ dipstick test ตรวจซีรั่ม
• 1.วางขวด Chase Buffer ไว้ ที่
อุณหภูมหิ ้ องให้ คลายความเย็นจากการเก็บไว้ ใน
ช่ องแข็งของตู้เย็น
• 2.ฉีกซองพลาสติก ดึงแผ่ น dipstick
test วางบนพืน้ ราบ
• 3. หยดซีรั่ม 20 µl บริเวณปลายศรชี้ของแผ่ น
• 4. เติม Chase Buffer 2-3 หยด
(150 µl) บริเวณเดียวกันกับหยดซีรั่ม
• 5. กรณีซีรั่มมีเชื้อลิชมาเนียจะปรากฏแถบสี แดง
ตาแหน่ ง T ภายใน 10 นาที หลังจากผ่ าน
เวลา 10 นาทีไปแล้ว ผลที่อ่านได้ จะคลาดเลือ่ น
• หมายเหตุ : ต้องหยดซีรั่มก่อน Chase
Buffer ทุกครั้ง
การอ่ านผล
• 1. ผลบวก (Positive result)
• แผ่ น dipstick test ที่มีผลบวกต่ อเชื้อ
L.donovani complex จะปรากฏ
แถบสี แดง ทั้งตาแหน่ ง T กับ C ดังภาพ 3 ขนาด
ของแถบสี แดงอาจแตกต่ างกันขึน้ อยู่กบั การมีจานวน
เชื้อลิชมาเนียมากหรือน้ อย แม้ ว่าแถบสี อาจแดงเรื่อ
เล็กน้ อย (weakly positive) ก็ให้ ระบุ
เป็ นผลบวกเช่ นเดียวกัน
• Test line (T)
•
Control line (C)
•
•
• ภาพ 3 dipstick test แสดงผลบวก
2. ผลลบ (Negative result)
ปรากฏแถบสี แดงเฉพาะตาแหน่ ง C เท่ านั้น
ดังภาพ 4
• No Test line is visible
•
Control line (C)
•
•
•
ภาพ 4
dipstick test แสดงผลลบ
3. ผลทีไ่ ม่ ถูกต้ อง (Invalid result)
• กรณีไม่ ปรากฏแถบสี แดง ที่ตาแหน่ ง T และ C
หรือปรากฏเพียงเฉพาะแถบ T อย่ างเดียว จะต้ อง
ตรวจซ้าด้ วย dipstick test ชิ้นใหม่
• พืน้ ที่ที่เป็ นแหล่ งแพร่ โรค(endemic
areas) ชุดตรวจมักมี ความไวส่ วนใหญ่
มากกว่ า 90% ส่ วนความจาเพาะขึน้ อยู่กบั แหล่ ง
ระบาดของโรค (geographic
location)
ข้ อจากัดชุดตรวจ dipstick test
• 1. dipstick test ใช้ ตรวจการมี
antibody เชื้อฯในสมาชิกกลุ่ม
L.donovani complex เท่ านั้น ไม่
สามารถใช้ ตรวจเชื้อชนิดอืน่ ๆของโรคลิชมาเนียได้
• 2. อาจมีบางกรณีผลตรวจเป็ น negative
แต่ ผู้ป่วยยังมีอาการของโรคอยู่ จึงต้ องตรวจและ
วินิจฉัยโรคด้ วยวิธีอนื่ ด้ วย
• 1. dipstick test ใช้ ตรวจการมี
antibody เชื้อฯในสมาชิกกลุ่ม
L.donovani complex เท่ านั้น
ไม่ สามารถใช้ ตรวจเชื้อชนิดอืน่ ๆ ของโรคลิ
ชมาเนียได้
• 2. อาจมีบางกรณีผลตรวจเป็ น
negative แต่ ผู้ป่วยยังมีอาการของโรคอยู่
จึงต้ องตรวจและวินิจฉัยโรคด้ วยวิธีอนื่ ด้ วย
• 3. ผลบวกที่เป็ นเท็จสามารถเกิดขึน้ ได้ กรณีมี
ข้ อสงสั ยอาจตรวจสอบซ้าด้ วยวิธีอนื่ ๆ ด้ วย
เช่ น การเพาะเลีย้ งเชื้อ (culture)
โดยเฉพาะรายที่ไม่ มีอาการ
• 4. ซีรั่มที่ปนเปื้ อน glycerol หรือ สาร
ปนเปื้ อนบางชนิด จะลดความไวของชุดตรวจฯ
Thank you for your
attention
by Sawart Cholphol
B.ed;M.ed