Transcript tra
Klónozás fogalma Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségével gazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunk Szubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása vektor Hasítás, A,B enzimekkel Hasítás, A,B enzimekkel A inszert A B B ligálás Transzformálás, felszaporítás, tisztítás Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni, Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb. KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT VEKTORTÍPUSOK példa plazmidok fonalas fágok fagemidek l fágok kozmidok BAC, YAC pUC18,19 mp18, 19 pBluescriptKS, SK± EMBL3,4 pHC79 pBAC108L, pYAC3 BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome PLAZMIDOK rezisztencia marker replikációs origo ORI Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek inszert méret < 10 - 15 kb < 5 - 10 kb < 10 - 15 kb néhányszor 10 kb néhányszor 10 kb néhány 100 kb NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM koncentráció (µg/ml) antibiotikum működési mód a rezisztencia módja ampicillin bakteriocid, sejt fal szintézis inhibitor a laktamáz elhidrolizálja az ampicillin laktám gyűrűjét 50 -100 klóramfenikol bakteriosztikus, fehérje szintézis inhibitor, kölcsönhat az 50S riboszoma alegységgel klóramfenikol acetiltranszferáz (cat) acetilálja a klóramfenikolt 20 kanamicin bakteriocid, fehérje szintézis inhibitor aminoglikozid foszfotranszferáz illetve nukleotidtranszferáz foszforilálja vangy adenilálja a kanamicint 30 - 500 tetraciklin bakteriosztatikus, proteinszintézis inhibitor, gátolja az aminoacil-tRNS kötődését a riboszómához a sejt permeabilitásának csökkentésével a tetraciklin nem tud bejutni a sejtbe 15 PÉLDÁK PLAZMID REPLIKONOKRA PLAZMID INKOMPATIBILTÁSI CSOPORT KÓPIASZÁM GAZDASPECIFICITÁS pBR322 ColE1 20 E. coli és még néhány pUC19 ColE1 300 E. coli és még néhány F plazmid FI 1-2 E. coli és még néhány pRK356 (R1, R6) FII 2 E. coli és még néhány pRK2501 (RK2) P 1-4 Gram-negatív baktériumokban széles RSF1010 Q 10 Gram-negatív baktériumokban széles pRK353 (R6K) X 13-40 Gram-negatív baktériumokban széles P1 Y 1-2 Gram-negatív baktériumokban széles Egy ősi plazmid: pBR322 Replikációs kontroll Magas kópiaszámú változat: pUC19 Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása -antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges - kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható - plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos - polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus gyors ha nincs más szelekció - kék fehér színszelekció, - pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént megszűnik a letalitás - auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén Kolónia hibridizáció LacZ a komplementáció F' plazmidon: defektív - galaktozidáz gén, hiányzik 11- 41. aminosav közötti régió bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiót és az 1-146 aminosavat a kettő együtt: aktív – galaktozidáz X-gal szubsztráttal kék telep a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad) ebbe lehet klónozni fragmentumot, ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment X-gal szubsztráttal fehér telep Egy pozitív szelekciós vektor Vektor önligálását, üres vektorok képződését gátló módszerek - kondicionálisan letális gének használata - vektor defoszforilálása -korrekt vektor/inszert arány megválasztása A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tud összekapcsolni, ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI 1. Kémiai transzformálás Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejt A sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük, sejtfal permeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá : transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNS elvi szám a transzformációt£ 1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre normál érték: 106 – 108 nagyon jó: 109 a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők: -oldatok edények tisztasága, - sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete - hősokk hőmérséklete hossza - permeabilizáló faktor a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé egyéb fogások: -spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezt transzformáljuk - a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt Transzformálás hatékonyságát meghatározó tényezők I. glicerin koncentráció, puffer pH, puffer koncentráció, sók növesztési hőmérséklet, OD Transzformálás hatékonyságát meghatározó tényezők II. hősokk hőmérséklete, hossza plazmid mérete tárolhatóság permealizáló ágens Elektroporáció A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású 600 ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-ig transzformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (1010/µg DNS) sejttípusonként optimalizálni kell maghatározó faktorok: - az oldat ellenállása - az impulzus nagysága, hossza - permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása KONJUGÁCIÓ Sejtből sejtbe történő DNS átadás lépései: párosodás: speciális kontaktus a donor és a recipiens között egy speciális sejtfelszíni ponton keresztül (pl. pilus) DNS átjuttatását közvetítő folyamatok, replikcáció (rolling circle, az egyik szál átjutása) konjugációs elemek donorból donort csinál az első ilyen a a szex faktor, F episzóma másik: IncPa csoportba tartozó: RP4, RK2 plazmidok (szilárd fázishoz mobilizálható plazmidok a recipiensből nem lesz donor a plazmid tartalmazza a DNS processzáló apparátust, oriT, mob régió tra gének, pilus: N-acetilált TraA A KONJUGÁCIÓ MECHANIZUMSA F pilus + F sejt - F sejt az F plazmid eltörik 5’ 3’ a DNS egyik szála átmegy a recipiensbe, mialatt a donorba a másik szál szintetizálódik 3’ 5’ 5’ DNS szintézis a recipiensben 5’ 3’ 3’ A DNS szintézis befejezõdik a sejtek szétválnak + F sejt F pilus + F sejt 5’ A DNS transzfer mechanizmusa a konjugáció során donor recipiens 5’ donor recipiens TraI 5 ’ Töréspont, nick donor TraI recipiens Egyszálú DNS kötő fehérje TraC primáz 5’ RNS primer Replikatív DNS polimeráz TraI Térképezés konjugációval Konjugatív génátviteli stratégiák Akceptor konjugáció Donor tra RP4 elõtt után vektor replikáció az utód sejtben + mob RP4 tra mob RP4 tra Tn5 mo b - - A konjugáció célja “sima” konjugáció Irányított mutagenezis, homológ rekombináción alapuló integráció Random, transzpozon alapú mutagenezis Mobilizálható vektorok Nem tartalmazzák a tra géneket, csak a transzferhez szükséges oriT-t tra gének: integrálva a kromoszómába, három komponensű konjugáció: sem a donor sejt sem a recipiens nem tartalmazza a transzferhez szükséges géneket, hanem egy harmadik sejt Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar2 Ar: antibiotikum rezisztencia Ar2 oriT oriV Ar1 Ar2 vad típus mutáns poláris hatás Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia oriT vad típus oriV Ar1 mutáns poláris hatás ?