Transcript MUTAGENEZIS

Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal
fehérjék
mRNS
sejtmag
sejtmembrán
Kromoszómális DNS
citolplazma
oligonukleotid
Cél molekula:
fehérje
mRNS
DNS
oligonukleotid
iránya
a leolvasással
megegyezõ v.
kettõsszálú
a leolvasással
ellentétes
a leolvasással
megegyezõ
RNS
DNS
duplex triplex
köcsönhatás
fehérje-DNS
RNS-DNS hibrid/
RNáz H
Hoogsteen féle
triplex
Gátlás
transzkripciós
szabályozás
transzláció
transzkripció
Triplex képződésének kölcsönhatásai
homopurin
homopirimidin
szekvenciáknál
Antiszensz oligonukleotidok lehetséges célszekvenciái
a mRNS-en
1)
2)
3)
4)
exon-intron határhoz, slicing gátlás
Az 5’ sapka régióhoz
Transzlációs iniciációs régióhoz
Génen belüli régióhoz
Kapcsolódó oligonukleotidok
Elsődleges hatásmechanizmus:
Az endogén RNázH leemészti a
DNS:RNS hibrid RNS szálát
Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer
B1
O
di-MeO Tr
O
O
2% DCA/DCM
O
B1
B1
O
O
O
AcO
HO
O
O
O
di-MeO Tr
hordozó
hordozó
hordozó
<1%
Ac2O
B1
O
HO
B2
O
di-MeO Tr
újabb ciklus
O
O
tetrazol
O
hordozó
N
O
NC
P N
O
> 99 %
B2
B2
O
di-MeO Tr
di-MeO Tr
O
I2 / H2O
O
O P O
O
O
O
O
O
B1
O
B1
O
NC
O
NC
O
P O
O
O
O
hordozó
hordozó
O
O
Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer
B1
O
di-MeO Tr
O
O
2% DCA/DCM
O
B1
B1
O
O
O
AcO
HO
O
O
O
di-MeO Tr
hordozó
hordozó
hordozó
<1%
Ac2O
B1
O
HO
B2
O
di-MeO Tr
újabb ciklus
O
O
tetrazol
O
hordozó
N
O
NC
P N
O
> 99 %
B2
B2
O
di-MeO Tr
di-MeO Tr
O
I2 / CS2
O
S P O
O
O
O
O
O
B1
O
B1
O
NC
O
NC
O
P O
O
O
O
hordozó
hordozó
O
O
Oligonukleotid szintézis: H-FOSZFONÁT MÓDSZER
B2
O
di-MeO Tr
B2
O
O
O
di-MeO Tr
O
OSi
O P H
O
B1
O
O
HO
O
B2
O
O
O
di-MeO Tr
O
OSi
O P H
B1
O
H lehet
Me is
O
O
O
O
O
O
OSi
O P O
B1
O
O
OSi
O
OSi
hordozó
hordozó
O
hordozó
Előny: az oxidációt elég a végén elvégezni,
vagy – igény szerint – el sem kell  töltés nélküli molekula
 Könnyebben átmegy a sejtfalon/membránon
OSi
PEPTID NUKLEINSAVAK (PNA)
Nincs cukorfoszfát gerinc, ehelyett peptid kötéssel összekapcsolt lánc van
Specifikus
Stabil
PNA T10-Lys
PNA SV40-Lys
TTTTTTTTTT-Lys
ATTTTCTTCATTTTTTCTTC-Lys
Ma már külön könyv van a PNA- alkalmazásairól
MUTAGENEZIS
- in vivo gének elrontására,vagy módosítására
Random mutagenezis
 találomra létrehozott mutációk
 mutagén anyagok:
UV, kemikáliák, radioaktív sugárzás
 PCR: a hőstabil polimerázok átírási hűsége rosszabb
 mutagén törzsek
 transzpozon mutagenezis
Irányított mutagenezis
Adott helyen
- deléciók inszerciók léterhozása
- pont mutációk létrehozása
Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis
Ar1
oriV
oriT
oriV: szűk gazdaspecificitás
Ar2
Ar: antibiotikum rezisztencia
Ar2
oriT
ori
Ar1
Ar2
vad típus
mutáns
poláris hatás
Deléciós mutagenezis a leolvasási keret
sértése nélül
Ar1
oriV
oriT
oriV: szűk gazdaspecificitás
Ar: antibiotikum rezisztencia
oriT
vad típus
ori
Ar1
mutáns
poláris hatás ?
Gének irányított mutagenezise a dut/ung rendszer alapján
pontmutációk!
Dut: dUTPase
Ung: uracil-N-glikoziláz
Ne épüljön be
dezoxiuracil
A DNS-be
in vitro szintézis, Klenow
QUICK CHANGE MUTAGENEZIS (STRATAGENE)
FEHÉRJE TERMELTETÉS
VAN GÉNÜNK:
Legyen az
prokarióta
vagy
eukarióta
természetes
vagy
szintetikus
vad típusú
vagy
mutáns
FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK
PROKARIÓTÁK
E. coli
ismert,
Bármilyen fehérje, feltéve, ha
- nem túl nagy
- nem túl kicsi
- nem túl hidrofób
- nincs túl sok cisztein benne
szekréciós rendszere minimális
Bacillus subtilis
jól ismert, ha nem is annyira,
mint az E. coli
van szekréciós rendszere
EUKARIÓTÁK
élesztő
gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal,
sok ismeretanyag
viszonylag könnyű kezelhetőség
poszttranszlációs modifikációk lehetősége
emlős sejtvonalak
 minden fajta fehérje termeltethető
bennük
 tranziens expressziós rendszerek
viszonylag gyors, de korlátozott
lehetôségek,
 stabil expressziós rendszerek
 hosszú, fáradságos optimalizálást igényel
Escherichia coli
ELŐNYÖK

 óriási mennyiségű ismeretanyag
 könnyű kezelhetőség, gyors növekedési sebesség, viszonylag olcsó médium
 nagy mennyiségű biomassza gazdaságos előállítása
 ismert szelekciós rendszerek
 legtöbb expressziós rendszer
HÁTRÁNYOK

 általában nem szekretál
 a sejten belül redukáló atmoszféra diszulfid hidak
kialakulása gátolt
 az eukariota poszttranszlációs módosítások általában nem
megvalósíthatóak
 nem alakul ki a megfelelő aktiv szerkezet, rossz folding
STRATÉGIÁK TÚLTERMELTETÉSRE
KONSTITUTÍV PROMÓTER
INDUKÁLT TERMELTETÉS
 a fehérje a teljes növekedési
fázis alatt expresszálódik
 a promoter represszált
állapotban van a növekedés
egy bizonyos fázisáig
 nagy sejttömeg elérése után
a fehérje visszanyerése
 nem igazán használatos,
toxicitási problémák miatt
 valamilyen indukcióval
derepresszió
 további növesztés
 fehérje visszanyerése
 legáltalánosabban használt
stratégia
 toxicitás sok esetben
megoldható
PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS
VEKTOR ELEMEI
SZF
GS
TSZE
Pr
-35 -10
SD
kódoló szekvencia
STOP
kodon
UAAU
UGA
UAG
-10
-35
TTGACAN17TATAAT
5’ UAAGGAGGN(3-11)
AR
Pr: promóter
TT: transzkripciós terminációs szignál,
SZF: szabályozó fehérje,,
TSZE: transzlációt szabályozó elemek,
SD: Shine-Dalgarno szekvencia,
TT
START kodon
AUG
GUG
UUG
ORI
AR: antibiotikum rezisztencia,
ORI: replikációs origo
GS: gazdasejt
A génexpresszió szabályozása
transzkripció
DNS
transzripciós
szinten
transzláció
RNS
FEHÉRJE
poszt-transzkcripciós
szinten
(mRNS degradáció, protein
stabilitás, stb.)
Különböző faktorok relatív hatása
a fehérje termeltetésre E. coli-ban
 Promóter indukálhatóság
kb. 1000 x
 Gazdasejt
kb. 1000 x
 A mRNS 5’ struktúrája
kb. 100 x
 Transzláció
kb. 100 x
 növekedési sebesség
(mRNS stabilitás)
kb. 50 x
PÉLDÁK PLAZMID REPLIKONOKRA
PLAZMID
INKOMPATIBILTÁSI CSOPORT
KÓPIASZÁM
GAZDASPECIFICITÁS
pBR322
ColE1
20
E. coli és még néhány
pUC19
ColE1
300
E. coli és még néhány
F plazmid
FI
1-2
E. coli és még néhány
pRK356
(R1, R6)
FII
2
E. coli és még néhány
pRK2501
(RK2)
P
1-4
Gram-negatív
baktériumokban széles
RSF1010
Q
10
Gram-negatív
baktériumokban széles
pRK353
(R6K)
X
13-40
Gram-negatív
baktériumokban széles
P1
Y
1-2
Gram-negatív
baktériumokban széles
túltermeltetésnél:
ne legyen nagyon magas a kópiaszám
 toxikus fehérjék alapexpressziójának
visszaszorítása
“Runaway” plazmidok:
indukálható kópiaszámú plazmidok
NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM
koncentráció
(µg/ml)
antibiotikum
működési mód
a rezisztencia módja
ampicillin
bakteriocid, sejt fal
szintézis inhibitor
a  laktamáz elhidrolizálja az
ampicillin  laktám gyűrűjét
50 -100
klóramfenikol
bakteriosztikus, fehérje
szintézis inhibitor,
kölcsönhat az 50S
riboszoma alegységgel
klóramfenikol acetiltranszferáz (cat)
acetilálja a klóramfenikolt
20
kanamicin
bakteriocid, fehérje
szintézis inhibitor
aminoglikozid foszfotranszferáz
illetve nukleotidtranszferáz
foszforilálja vangy adenilálja a
kanamicint
30 - 500
tetraciklin
bakteriosztatikus,
proteinszintézis inhibitor,
gátolja az aminoacil-tRNS
kötődését a riboszómához
a sejt permeabilitásának
csökkentésével a tetraciklin nem tud
bejutni a sejtbe
15
TRANSZKRIPCIÓ
 Iniciáció
fehérje termeltetés során a legfontosabb
 Elongáció
mivel a gén belsejében van, nem manipulálható
 Termináció
a transzkripció befejezése,
a transzkripciós apparátus
túlterhelésének elkerülésére
A transzkripció iniciációja prokariótákban
sigma faktor
holoenzim
NTD


CTD CTD
/`
?
RNS polimeráz
5’
promóter
3’
3’
5’
k1
, `, , , 
k-1
5’
3’
3’
5’
k2
RNS polimeráz alegységek:
k-2
5’
3’
3’
5’
Ha k1 >> k-1, akkor a polimeráz
holoenzim nagyon erősen kötődik
a promóter szekvenciához,
a polimeráz nehezen tudja
elindítani a polimerizációs reakciót.
Tehát a transzkript mennyisége csökken,
habár in vitro a promóter
és a holoenzim közötti kapcsolat erős.
70 promoter szekvencia: -10 and -35 régiók
A tökéletes 70-függő promóter
UP elem
-35
Ext. -10
D +1
AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattA
14nt
4-6nt
17nt
Az  alegység kötődik
A 70 ismeri fel
4-6nt
Bakteriális  faktorok
konszenzus szekvencia
Típus
NÉV
elsődleges  faktorok
Nem esszenciális 
faktorok
Alternatív  faktorok
Flagella  faktorok
ECF  faktorok
hősokk  faktorok
70, RpoD, SigA
sporulációs 
faktorok
-35
távolság
-10
TTGACA
16 - 18
TATAAT
38, RpoS,
CTATACT
28, FliA, SigD
E, SigE
32, RpoH
B, SigB
TAAA
GAACTT
CTTGAAA
GTTTAAA
15
16 - 17
11 - 16
12 - 14
GCCGATAA
TCTRA
CCCATNT
RGAAT
H, SphOH
AGGAWWT
12 - 14
RGAAT
F, SpoIIAC
E, SpoIIGB
G, SpoIIIG
WGCATA
GKCATATT
TGAATA
-24
TGGCAC
14 - 15
13 - 15
17 - 18
GGNRAYAMTW
CATACAMT
CATACTA
-12
TTGCW
54 család
N, RpoN, SigL
5
Különböző gének expresszióját különböző
szigma faktorok befolyásolják
tápelvonás,
Stressz,
Vasra éheztetés,
sejtsűrűség,
Felületi adházió
Transzkripciós faktorok
(Szigma)
gén expresszió változás

Morfológiai & fiziológiás változások

Adaptáció / Védekezés
Két  faktor felépítése
A génexpresszió tanulmányozása különböző
módszerekkel különböző szinteken
Enzim
aktivitás
mérés
Western blot
fehérje
detektálása
fehérje
érése
transzláció
transzkripció
promóter
Riportergén
riporter fehérje
aktivitás 
promóter aktivitás
mRNS
detektálása
A vizsgált
operon
ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) I.
 más néven gél retardációs assay
 a DNS-t, amely feltételezhetően fehérjét köt, megjelöljük
 jelölés lehet végen, szálon belül, egyszálon, kétszálon, kötési kísérletben a DNS kétszálú!
 a DNS ne legyen től hosszú 20-200 bp, minél hosszabb a DNS, annál több nem specifikus
reackió történik
 lehet tiszta fehérje vagy fehérje populáció
Natív poliakrilamid gél
-: fehérje nélkül, +: fehérjével összekeverve
DNS
-
+
-
+
jelölés
DNS kötő
fehérje
összekeverés
nem kötődik
kötődik
nem kötődik
-
+
kötődik
nem specifikusan kötődik
ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) II.
 a mobilitás eltolódás inkább a komplex méretét jellemzi, a kölcsönhatás errősségét nem
 a kölcsönhatás erősségét a nem kötöt DNS, és a kötésben levő DNS jelének intenzitása jellemzi
minél kevesebb fehérje okoz erős jelet az eltolódott sávban annál erősebb a kölcsönhatás
titrálás fehérje mennyiségre
SUPERSHIFT ASSAY
- ha van tippünk, hogy milyen fehérje kötődik
- és van rá specifikus ellenanyagunk
hozzáadott fehérje mennyiség nő 
-
+
nem kötődik
kötődik
-
a DNS - fehérje kölcsönhatás erősségéről ad
felvilágosítást,
nem a képződött mRNS mennyiségéről
+
ellenanyag is kötődik
++
-: fehérje nélkül, +: csak fehérje hozzáadása,
++: fehérje és ellenanyag hozzáadása
DNázI FOOT PRINT I.
DNS hossz 100 – 200 bp
DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan
denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis
mind a két jelölt szállal meg kell csinálni
a kötési kísérletben a DNS kétszálú
********************
Maxam-Gilbert
létra
G A+G C+T
C
DNázI hasítás
D
DNázI
********************
DNázI FOOT PRINT II.
********
********
DNázI hasítás
Maxam-Gilbert -: fehérje nélkül
+: fehérje jelenlétében
létra
G A+G C+T
C
D- D+
hiperszenzitív
hely (HSH)
DNázI
HSH
********
********
METILÁCIÓS INTERFERENCIA
DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan
a DNS-t Maxam-Gilbert szerint dimetilszulfáttal (DMS) metiláljuk
mind a két jelölt szállal meg kell csinálni
denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis
a kötési kísérletben a DNS kétszálú
G
G
piperidin
hasítás MeG-nél
Maxam-Gilbert
létra
********
Me
G A+G C+T
C
G
Me
Me
G
G
G
G
G
G
csak a jelölt szálon szemléltetve
piperidin
Me
********
DMS
METILÁCIÓS INTERFERENCIA II.
modell:
PM és NK
mintázat
DMS
piperidin
hasítás MeG-nél
Maxam-Gilbert
létra
G A+G C+T
C
PM
K
NK
K mintázat
tegyük fel, hogy
ezek a G-k
esszenciálisak a
kötéshez
EMSA
********

NK: nem kötött
PM: protein mentes


*
K: kötött
+
kivágás,
izolálás piperidin hasítás
denaturáló PAGE
**
-
UV KERESZTKÖTÉS (CROSS LINKING)
Ismeretlen DNS kötő fehérjék molekulatömegének becslésére
1. A DNS szálat szálon belül jelöljük, és Br-dUMP-t építünk be
(a Br-dUMP nem zavarja a kötődést)
minta marker
: Br
MS?
SDS-PAGE
jelölt fehérje
DNázI kezelés
EMSA
UV fény
kivágás, izolálás

a fehérje DNS komplex kötés
kovalens lesz
A mRNS mennyiségének meghatározása
- Northern-blot és hibridizáció
- reverz-transzkripció kapcsolt kvantitatív PCR
- korrekt, de belső összehasonlító standardokat igényel
In vitro transzkripció
Regulátor
régió
G mentes kazetta
(3-400 bp)
Promóter
transzkripcionálisan aktív sejt
vagy sejtmagi extraktum
+ ATP, CTP, 32P-UTP,
a képződött radioaktív RNS analizise denaturáló PAGE-n.
csak a fenti 3-400 bp-os fragmentum fog látszani, a többi
tartalmaz G-t  ezek transzkirpciója leáll
mennyiségi becslés: denzitometriásan, vagy
PhosphorImager-rel
elsősorban transz szabályozó elemek hatásának vizsgálatára alkalmas
Riporter gének alkalmazása
Regulátor
régió
riporter gén (pl. lacZ)
Promóter
SEJT
-galaktozidáz (LacZ)
-galaktozidáz
aktivitás mérés
feltételezi, hogy nincs poszt-transzkripciós szabályozás,
és az enzim specifikus aktivitása is minden mintára egyforma
aktivitás mérés kiküszöbölése
GFP: Green Fluorescent Protein, gerjesztve floureszkál
a kapott aktivitást illetve szignált normálni kell a sejt vagy protein mennyiségére