Transcript E. coli

Centrális dogma és a bioinformatika főbb
területei a molekuláris biológiában
Gén
DNS
transzkripció, RNS szerkesztés
transzkriptomika
RNS
degradáció
transzláció, poszttranszlációs
módosítás
fehérje
proteomika
degradáció
biokémiai aktivitás
metabolikus útvonalak
metabolomika
1
A BIOLÓGIAI INFORMÁCIÓ HORDOZÓ
MEGFEJTÉSE
GENOMIKA
A teljes genetikai állomány szekvenciájának meghatározása,
A szekvenciákon elhelyezkedő funkcionális régiók számítógépes
jóslása: annotálás
2
Funkcionális genomika RNS szinten
TRANSZKIPTOMIKA
3
Egy DNS chip kísérlet folyamatábrája
A chipek kiértékelése, eredménye
5
Funkcionális genomika fehérje szinten
PROTEOMIKA
6
Proteomika
EgyTipikus protokol
Izoelektromos fókuszálás
SDS PAGE
Minta elő
Protein azonosítás
tömegspektrometria
Láthatóvá tétel
Protein pötty
kivágás
Kép analízis
8
Proteomika: az elválasztástól az azonosításig
9
Oligonukleotid szintézis
Mintegy 50 éves múlt
5 különböző kémia: foszfáttriészter, fosztittriészter, foszfátdiészter
Foszforamidit, H-foszfonát
Szilárd fázisú szintézis:
hordozó: controlled pore glass (CPG), vagy polisztirol
Mind DNS mind RNS szintetizálható
mind a két módszerrel
Oligonukleotid szintézis: monomerek
Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer
B1
O
di-MeO Tr
O
O
2% DCA/DCM
O
B1
B1
O
O
O
AcO
HO
O
O
O
di-MeO Tr
hordozó
hordozó
hordozó
<1%
Ac2O
B1
O
HO
B2
O
di-MeO Tr
újabb ciklus
O
O
tetrazol
O
hordozó
N
O
NC
P N
O
> 99 %
B2
B2
O
di-MeO Tr
di-MeO Tr
O
I2 / H2O
O
O P O
O
O
O
O
O
B1
O
B1
O
NC
O
NC
O
P O
O
O
O
hordozó
hordozó
O
O
Néhány automata szintetizátor
OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE I.
- Deblokkolás: védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás
A lúg hatására lehasad:
- védőcsoportok a bázisokról
- -cianoetil csoport a fosztátról
- oligo a hordozóról
- liofilezés, sómentesítés
OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE II.
- méret szerinti elválasztás, PAGE, vagy HPLC (sokszor nem szükséges)
Ioncserés kromatográfia
- kvantitálás
bázis
dA
dG
dC
dT
átlagosan
Hidrofób kromatográfia a
DMT csoporton keresztül
e(µmol * cm/cm3)
15.4
11.7
7.5
8.8
e = 10 (µmol * cm)/cm3
OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK
-
primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis
-
linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele
-
adapterek: különböző (nem-kompatibilis)
ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével
-
hibridizációs próbák, DNS diagnosztika
-
antiszensz oligonukleotidok, génterápia
-
gén darabok
-
egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.
Linkerek
rövid, önkomplemeter oligonukleotidok, amelyek saját magukhoz hibridizálva
olyan tompa végű, kettősszálú DNS-t képeznek, amely tartalmazza egy
tetszőleges restrikciós endukleáz felismerő helyét:
Restrikciós hely bevitelére alkalmas
BamHI...........CGGATCCG
EcoRI...........GGAATTCC
PstI............GCTGCAGC
ADAPTEREK
szintetikus kettősszálú oligonukleotidok, amelyek végei kompatibilisek
különböző restrikciós endukleázokkal végzett emésztések során képződő végekkel.
Esetenként valamilyen restrikciós endonukleáz felismerőhelyét tartalmazhatja.
Rövid adapterek:
egyik vég ragadós, a másik tompa.
EcoRI
EcoRI – SmaI...5'AATTCCCGGG 3‘
3’GGGCCC 5’
SmaI
Hosszú adapterek:
két ragadós vég között egy
harmadik restrikiós endonukleáz felismerõhelye
pl. BamHI (ApaI)
SacI
5' GATCCGGGCCCTGTTAGAGCT 3'
3' GCCCGGGACAATC 5'
Primerek
szintetikus oligodeoxinukleotidok, amelyek iniciációs pontjaiként szolgálnak a
templát függő DNS polimerázok számára.
Univerzális primerek: a gyakorlatban elterjedt vektorok klónozó helyének
környékére tervezett primerek.
Specifikus primerek: az adott feladatnak megfelelően szintetizált
speciális szekvenciájú oligonukleotidok.
Polimeráz láncreakció I.
Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb.
Soknak nincs 3’  5’ exonukleáz aktivitása  “A” túlnyúló
Polimeráz láncreakció II.
A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ MÓDOZATAI
- belső PCR, specificitás növelése belső primerek
használatával egy elsődleges PCR terméken
- egy specifikus primert használó PCR + primer adapter
limitált információ esetén
- LM PCR, ligálás közvetített PCR,
kromoszóma metiláltsági térképezésére
- inverz PCR, szegélyező szekvenciák izolálására
- “farkazott PCR” ld. cDNS izolálás
- RT PCR, reverz transzkripció kapcsolt PCR, ld. cDNS
- kvantitatív PCR, mRNS mennyiségének becslésére
A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ
FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI
 klónozás, megfelelő DNS szakaszok kinyerése,
esetenként degenerált primerekkel
 DNS szekvenálás, pl. ThermoSequenase
 mutagenezis
 szálspecifikus próbák előállítása
 diagnosztika
 fertőzések kimutatására
 mutáns allélek kimutása
BELSŐ (NESTED) PCR
1. PCR
2. PCR
2 primer párt használunk
 nagyobb specificitás, a nemspecifikus termékek eltűnése
 költségesebb
INVERZ PCR
A géneket környező régiók kiamplifikálkására
Általában a gén szekvenciája részben vagy teljesen ismert 
primer pár tervezhető
A
A
A
hasítás 'A' restrikciós
enzimmel
önligálás
A
PCR
'A'
A
REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT PCR
(RT-PCR)
antiszensz primer
mRNS
reverz transzkripció reverz transzkriptázzal
AMV: avian mieloblastosis virus RT
MMLV: Moloney murine leukémia vírus RT
Tth: Thermus thermophilus, Mn2+ jelenlétében
cDNS
szensz primer
PCR
Gének szerveződésének
1000
vizsgálatára
750
500
250
bp
RT+
RT-
gK
REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT
KVANTITATÍV PCR
Az RNS preparátumnak
DNS mentesnek kell lennie
termék
plató
lineráris szakasz
exponenciális rész
ciklus szám
Hagyományos PCR-rel igen nehéz a termék mennyiségének a meghatározása
Real-time PCR
T
95°C
72°C
50°C
Denaturálás
: SYBRGreenI
Hibiridizáció
DNA szintézis
: fluorescens SYBRGreenI
Denaturálás
Real-time PCR reakció analízise
Kalibráció ismert mennyiségű genomiális DNS-sel
reprodukálhatóság ismeretlen mennyiségű templát cDNA-sel.
gDNA:
280ng
28ng
2.8ng
0.28ng
0.028ng
A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ
FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: klónozás
A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ
FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: mutagenezis
random:
a Taq polimeráz átírási hűsége rosszabb,
hibák épülnek be és amplifikálódnak
1-2 hiba 1 kb hosszon
Mn2+ vagy nukleotid analógok (inozin) növelik a mutációs rátát
in vitro evolúció
irányított:
O1
Mf
XhoI
BamHI
O2
Mr
O1-Mr
1st PCR-s
Mf –O2
O1
BamHI
XhoI
CO2
2nd PCR
O1 – O2
BamHI
XhoI
digest with XhoI and BamHI
ligate into XhoI – BamHI digested vector
A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I.
- FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA
minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav,
ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket 
speciálisan tervezett primerek segítségével PCR
a termék megjelenése fertőzésre utal
A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II.
MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA
normális
A
C
mutáns
5'
3'
gén
5
'
5
'
A 3'
A
3'
C
PCR
nincs termék
egészséges
5
'
beteg
5
'
C 3'
A
3'
C
PCR
nincs termék
beteg
egészséges
Ligálás és a PCR kombinálása
GÉNSZINTÉZIS STRATÉGIÁK
1. Szintetikus DNS fragmentek összeállítása átfedő oligomerekből
1. fragment
2. fragment
1+2. fragment
3. fragment
1+2. fragment
1+2+3. fragment
hátrány: drága,
mind a két szálat meg kell szintetizálni
2. Fragment összeállítás primer-templát módszerrel
5’
3’
3’
5’
Klenow, dNTP
5’
3’
3’
5’
Több verzió is erre az enzimatikus feltöltési elvre alapszik.
2.a. Hajtű módszer
5’
3’
Klenow, dNTP
emésztés restrikciós endonuklázokkal
ligálás
Híd ligálás
2. c. Fragment összeállítás a
javító mechanizmus
(gap repair) kihasználásával
5’
3’
3’
5’
3’
5’
átfedő szintetikus
oligonukleotidok
hasított vektor
hasított vektor
polimerizáció
Klenow, dNTP
ligálás
transzformálás
hibridizálás,
enzimatikus
feltöltés
5’
3’
3’
5’
közvetlen
transzformálás
Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal
fehérjék
mRNS
sejtmag
sejtmembrán
Kromoszómális DNS
citolplazma
oligonukleotid
Cél molekula:
fehérje
mRNS
DNS
oligonukleotid
iránya
a leolvasással
megegyezõ v.
kettõsszálú
a leolvasással
ellentétes
a leolvasással
megegyezõ
RNS
DNS
duplex triplex
köcsönhatás
fehérje-DNS
RNS-DNS hibrid/
RNáz H
Hoogsteen féle
triplex
Gátlás
transzkripciós
szabályozás
transzláció
transzkripció
Triplex képződésének kölcsönhatásai
homopurin
homopirimidin
szekvenciáknál
Antiszensz oligonukleotidok lehetséges célszekvenciái
a mRNS-en
1)
2)
3)
4)
exon-intron határhoz, slicing gátlás
Az 5’ sapka régióhoz
Transzlációs iniciációs régióhoz
Génen belüli régióhoz
Kapcsolódó oligonukleotidok
Elsődleges hatásmechanizmus:
Az endogén RNázH leemészti a
DNS:RNS hibrid RNS szálát
Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer
B1
O
di-MeO Tr
B1
O
O
2% DCA/DCM
O
B1
O
O
O
AcO
HO
O
O
O
di-MeO Tr
hordozó
hordozó
hordozó
<1%
Ac2O
B1
O
HO
B2
O
di-MeO Tr
újabb ciklus
O
O
tetrazol
O
hordozó
N
O
NC
P N
O
> 99 %
B2
B2
O
di-MeO Tr
di-MeO Tr
O
I2 / CS2
O
S P O
O
O
O
O
O
B1
O
B1
O
NC
O
NC
O
P O
O
O
O
hordozó
hordozó
O
O
PEPTID NUKLEINSAVAK (PNA)
Nincs cukorfoszfát gerinc, ehelyett peptid kötéssel összekapcsolt lánc van
Specifikus
Stabil
PNA T10-Lys
PNA SV40-Lys
TTTTTTTTTT-Lys
ATTTTCTTCATTTTTTCTTC-Lys
Ma már külön könyv van a PNA- alkalmazásairól
MUTAGENEZIS
- in vivo gének elrontására,vagy módosítására
Random mutagenezis
 találomra létrehozott mutációk
 mutagén anyagok:
UV, kemikáliák, radioaktív sugárzás
 PCR: a hőstabil polimerázok átírási hűsége rosszabb
 mutagén törzsek
 transzpozon mutagenezis
Irányított mutagenezis
Adott helyen
- deléciók inszerciók léterhozása
- pont mutációk létrehozása
Gének irányított szétroncsolása: interpozon mutagenezis
Ar1
oriV
oriT
oriV: szűk gazdaspecificitás
Ar2
Ar: antibiotikum rezisztencia
Ar2
oriT
ori
Ar1
Ar2
vad típus
mutáns
poláris hatás
Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélül
Ar1
oriV
oriT
oriV: szűk gazdaspecificitás
Ar: antibiotikum rezisztencia
oriT
vad típus
ori
Ar1
mutáns
poláris hatás ?
QUICK CHANGE MUTAGENEZIS (STRATAGENE)
FEHÉRJE TERMELTETÉS
VAN GÉNÜNK:
Legyen az
prokarióta
vagy
eukarióta
természetes
vagy
szintetikus
vad típusú
vagy
mutáns
FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK
PROKARIÓTÁK
E. coli
ismert,
Bármilyen fehérje, feltéve, ha
- nem túl nagy
- nem túl kicsi
- nem túl hidrofób
- nincs túl sok cisztein benne
szekréciós rendszere minimális
Bacillus subtilis
jól ismert, ha nem is annyira,
mint az E. coli
van szekréciós rendszere
EUKARIÓTÁK
élesztő
gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal,
sok ismeretanyag
viszonylag könnyű kezelhetőség
poszttranszlációs modifikációk lehetősége
emlős sejtvonalak
 minden fajta fehérje termeltethető
bennük
 tranziens expressziós rendszerek
viszonylag gyors, de korlátozott
lehetőségek,
 stabil expressziós rendszerek
 hosszú, fáradságos optimalizálást igényel
Escherichia coli
ELŐNYÖK 
 óriási mennyiségű ismeretanyag
 könnyű kezelhetőség, gyors növekedési sebesség, viszonylag olcsó médium
 nagy mennyiségű biomassza gazdaságos előállítása
 ismert szelekciós rendszerek
 legtöbb expressziós rendszer
HÁTRÁNYOK 
 általában nem szekretál
 a sejten belül redukáló atmoszféra diszulfid hidak
kialakulása gátolt
 az eukarióta poszttranszlációs módosítások általában nem
megvalósíthatóak
 nem alakul ki a megfelelő aktiv szerkezet, rossz folding
STRATÉGIÁK TÚLTERMELTETÉSRE
KONSTITUTÍV PROMÓTER
INDUKÁLT TERMELTETÉS
 a fehérje a teljes növekedési
fázis alatt expresszálódik
 a promoter represszált
állapotban van a növekedés
egy bizonyos fázisáig
 nagy sejttömeg elérése után
a fehérje visszanyerése
 nem igazán használatos,
toxicitási problémák miatt
 valamilyen indukcióval
derepresszió
 további növesztés
 fehérje visszanyerése
 legáltalánosabban használt
stratégia
 toxicitás sok esetben
megoldható
PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR
ELEMEI
SZF
GS
TSZE
Pr
-35 -10
SD
kódoló szekvencia
STOP
kodon
UAAU
UGA
UAG
-10
-35
TTGACAN17TATAAT
5’ UAAGGAGGN(3-11)
AR
Pr: promóter
TT: transzkripciós terminációs szignál,
SZF: szabályozó fehérje,,
TSZE: transzlációt szabályozó elemek,
SD: Shine-Dalgarno szekvencia,
TT
START kodon
AUG
GUG
UUG
ORI
AR: antibiotikum rezisztencia,
ORI: replikációs origo
GS: gazdasejt
A génexpresszió szabályozása
transzkripció
DNS
transzkripciós
szinten
transzláció
RNS
FEHÉRJE
poszt-transzkripciós
szinten
(mRNS degradáció, protein
stabilitás, stb.)
Különböző faktorok relatív hatása
a fehérje termeltetésre E. coli-ban

Promóter indukálhatóság
kb. 1000 x

Gazdasejt
kb. 1000 x

A mRNS 5’ struktúrája
kb. 100 x

Transzláció
kb. 100 x

növekedési sebesség
(mRNS stabilitás)
kb. 50 x
TRANSZKRIPCIÓ
 Iniciáció
fehérje termeltetés során a legfontosabb
 Elongáció
mivel a gén belsejében van, nem manipulálható
 Termináció
a transzkripció befejezése,
a transzkripciós apparátus
túlterhelésének elkerülésére
A transzkripció iniciációja prokariótákban
sigma faktor
holoenzim
NTD


CTD CTD
/`
?
RNS polimeráz
5’
promóter
3’
3’
5’
k1
, `, , , 
k-1
5’
3’
3’
5’
k2
RNS polimeráz alegységek:
k-2
5’
3’
3’
5’
Ha k1 >> k-1, akkor a polimeráz
holoenzim nagyon erősen kötődik
a promóter szekvenciához,
a polimeráz nehezen tudja
elindítani a polimerizációs reakciót.
Tehát a transzkript mennyisége csökken,
habár in vitro a promóter
és a holoenzim közötti kapcsolat erős.
70 promoter szekvencia: -10 and -35 régiók
Bakteriális  faktorok
konszenzus szekvencia
Típus
NÉV
elsődleges  faktorok
Nem esszenciális 
faktorok
Alternatív  faktorok
Flagella  faktorok
ECF  faktorok
hősokk  faktorok
70, RpoD, SigA
sporulációs 
faktorok
-35
távolság
-10
TTGACA
16 - 18
TATAAT
38, RpoS,
CTATACT
28, FliA, SigD
E, SigE
32, RpoH
B, SigB
TAAA
GAACTT
CTTGAAA
GTTTAAA
15
16 - 17
11 - 16
12 - 14
GCCGATAA
TCTRA
CCCATNT
RGAAT
H, SphOH
AGGAWWT
12 - 14
RGAAT
F, SpoIIAC
E, SpoIIGB
G, SpoIIIG
WGCATA
GKCATATT
TGAATA
-24
TGGCAC
14 - 15
13 - 15
17 - 18
GGNRAYAMTW
CATACAMT
CATACTA
-12
TTGCW
54 család
N, RpoN, SigL
5
Különböző gének expresszióját különböző
szigma faktorok befolyásolják
tápelvonás,
Stressz,
Vasra éheztetés,
sejtsűrűség,
Felületi adházió
Transzkripciós faktorok
(Szigma)
gén expresszió változás

Morfológiai & fiziológiás változások

Adaptáció / Védekezés
Két  faktor felépítése
A génexpresszió tanulmányozása különböző
módszerekkel különböző szinteken
Enzim
aktivitás
mérés
Western blot
fehérje
detektálása
fehérje
érése
transzláció
transzkripció
promóter
Riportergén
riporter fehérje
aktivitás 
promóter aktivitás
mRNS
detektálása
A vizsgált
operon
ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) I.
 más néven gél retardációs assay
 a DNS-t, amely feltételezhetően fehérjét köt, megjelöljük
 jelölés lehet végen, szálon belül, egyszálon, kétszálon, kötési kísérletben a DNS kétszálú!
 a DNS ne legyen től hosszú 20-200 bp, minél hosszabb a DNS, annál több nem specifikus
reackió történik
 lehet tiszta fehérje vagy fehérje populáció
Natív poliakrilamid gél
-: fehérje nélkül, +: fehérjével összekeverve
DNS
-
+
-
+
jelölés
DNS kötő
fehérje
összekeverés
nem kötődik
kötődik
nem kötődik
-
+
kötődik
nem specifikusan kötődik
ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) II.
 a mobilitás eltolódás inkább a komplex méretét jellemzi, a kölcsönhatás errősségét nem
 a kölcsönhatás erősségét a nem kötöt DNS, és a kötésben levő DNS jelének intenzitása jellemzi
minél kevesebb fehérje okoz erős jelet az eltolódott sávban annál erősebb a kölcsönhatás
titrálás fehérje mennyiségre
SUPERSHIFT ASSAY
- ha van tippünk, hogy milyen fehérje kötődik
- és van rá specifikus ellenanyagunk
hozzáadott fehérje mennyiség nő 
-
+
nem kötődik
kötődik
-
a DNS - fehérje kölcsönhatás erősségéről ad
felvilágosítást,
nem a képződött mRNS mennyiségéről
+
ellenanyag is kötődik
++
-: fehérje nélkül, +: csak fehérje hozzáadása,
++: fehérje és ellenanyag hozzáadása
DNázI FOOT PRINT I.
DNS hossz 100 – 200 bp
DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan
denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis
mind a két jelölt szállal meg kell csinálni
a kötési kísérletben a DNS kétszálú
********************
Maxam-Gilbert
létra
G A+G C+T
C
DNázI hasítás
D
DNázI
********************
DNázI FOOT PRINT II.
********
********
DNázI hasítás
Maxam-Gilbert -: fehérje nélkül
+: fehérje jelenlétében
létra
G A+G C+T
C
D- D+
hiperszenzitív
hely (HSH)
DNázI
HSH
********
********
UV KERESZTKÖTÉS (CROSS LINKING)
Ismeretlen DNS kötő fehérjék molekulatömegének becslésére
1. A DNS szálat szálon belül jelöljük, és Br-dUMP-t építünk be
(a Br-dUMP nem zavarja a kötődést)
minta marker
: Br
MS?
SDS-PAGE
jelölt fehérje
DNázI kezelés
EMSA
UV fény
kivágás, izolálás

a fehérje DNS komplex kötés
kovalens lesz
A mRNS mennyiségének meghatározása
- Northern-blot és hibridizáció
- reverz-transzkripció kapcsolt kvantitatív PCR
- korrekt, de belső összehasonlító standardokat igényel
In vitro transzkripció
Regulátor
régió
G mentes kazetta
(3-400 bp)
Promóter
transzkripcionálisan aktív sejt
vagy sejtmagi extraktum
+ ATP, CTP, 32P-UTP,
a képződött radioaktív RNS analizise denaturáló PAGE-n.
csak a fenti 3-400 bp-os fragmentum fog látszani, a többi
tartalmaz G-t  ezek transzkirpciója leáll
mennyiségi becslés: denzitometriásan, vagy
PhosphorImager-rel
elsősorban transz szabályozó elemek hatásának vizsgálatára alkalmas
Riporter gének alkalmazása
Regulátor
régió
riporter gén (pl. lacZ)
Promóter
SEJT
-galaktozidáz (LacZ)
-galaktozidáz
aktivitás mérés
feltételezi, hogy nincs poszt-transzkripciós szabályozás,
és az enzim specifikus aktivitása is minden mintára egyforma
aktivitás mérés kiküszöbölése
GFP: Green Fluorescent Protein, gerjesztve floureszkál
a kapott aktivitást illetve szignált normálni kell a sejt vagy protein mennyiségére
Gének koordinált regulációjának
két fő mechanizmusa baktériumokban
A) operon: gének egy lókuszban, közös transzkript, közös regulátor
policisztronos elrendezés
B) regulon: gének szétszórva a genomban, közös regulátor
operon
regulon
A TRANSZKRIPCIÓS SZABÁLYOZÁS FŐBB
GLOBÁLIS STRATÉGIÁI PROKARIÓTÁKBAN
negatív szabályozás
pozitív szabályozás
KATABOLIKUS
KATABOLIKUS
indukálószer
inaktív
aktivátor
represszor
indukálószer
indukció
inaktív
represszor
represszált
RNS polimeráz
aktív
aktivátor
derepresszált
inaktív
RNS polimeráz
BIOSZINTETIKUS
BIOSZINTETIKUS
indukálószer
indukálószer
inaktív represszor
represszió
aktív
represszor
derepresszált
RNS polimeráz
represszált
RNS polimeráz
aktív aktivátor
inaktív
aktivátor
indukált
inaktív
A transzkripciós faktorok és aDNS közötti
specifikus kölcsönhatás
Hélix-turn-hélix (HTH) Motívumok:
csgD: NNEIARSLFISENTVKTH LY
merR: IGEVALLCDINPVTLRAWQR
luxR: SWDISKILGCSERTVTFHLT
lehet a faktor N vagy C terminálisán,
a másik végen szokott lenni a ligand, kofaktor kötő régió
BAKTERIÁLIS TRANSZKRIPCIÓS FAKTOROK
FŐBB CSALÁDJAI
Faktor család
Tagok
AraC család
AraC, MelR, RhaS, RhaR, SoxS
LysR család
LysR, OxyR, MetR, CysB
Crp család
Crp, Fnr
MerR család
SoxR
Két komponensű
szabályozó család
NarL, OmpR, Arc
Lac represszor család
LacI, GalR
MetJ család
MetJ
Aktiváció a gén expresszióban I.
Kölcsönhatás:
- CTD-nel (CRP)
- 70 4-es régiójával ( cI aktivátor)
- NTD-nel (CRP)
-  alegységgel (DnaA)
- ’ alegységgel
(N4 single-stranded DNA kötő fehérje)
- CTD-nel és 70 4-es régiójával (FNR)
Positive activation of gene expression
Virgil A Rhodius, Stephen JW Busby
Current Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159.
Aktiváció a gén expresszióban II.
Promóter konformáció
megváltoztatása:
- “-35” és “-10” régió azonos oldalra
kerül (MerR, SoxR)
- DNS visszahajlik és az aktiváló cis
szekvencia RNAP fölé kerül
- DNS konformáció változást indukál
(FIS, IHF)
Positive activation of gene expression
Virgil A Rhodius, Stephen JW Busby
Current Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159.
Távoli aktivátor helyek segítséget igényelnek
DNS-hajlító fehérje
(pl. IHF)
Specifius kötőhely
Transzkripció repressziója baktériumokban
FNR
- fumarát nitrát reduktáz regulátor
- citoplazmatikus szenzor-regulátor
O2
- dimer[4Fe-4S]2+ DNS-t köt
FNRox
- monomer[2Fe-2S]2+ inaktív
- aenaerob respirációra (+) vagy (-) hatás
- pO2 1 mbar alatt
- TTGAT-N4-ATCAA konszenzus szekvencia
- [2Fe-2S]2+ 
[4Fe-4S]2+ (in vitro)
Cys, Fe, DTT, NifS
- Pseudomonas: ANR; Bacillus: FNR
Rhodobacter sphaeroides: FnrL
FNRred
Két komponensű szabályozó rendszerek
Komponensek
- egy szenzor kináz és egy DNS kötő regulátor
- E. coli genom 2%
- kb 50 különböző 2 komponensű rendszer
- 3 alcsalád: OmpR, FixJ és NtrC
A bakteriális kétkomponensű szabályozó rendszerek
működése elve
szenzor kináz fehérje
Érzékelő Foszforilációs
DNS kötő fehérje
szignál
P
DNS
Érzékelő Foszforilációs
Felvevő
DNS kötő
transzfoszforiláció
P
DNS
Érzékelő Foszforilációs
Felvevő
DNS kötő
ArcA/B
- aerobic respiratory control
- ArcB (szenzor kináz): sejt redox és metabolikus helyzet
(elektron transzport változást érzékel)
- ArcA(citoplazmatikus regulátor): ArcB foszforilálja  aktív
- pO2 1-5 mbar között
- TATTTaa konszenzus szekvencia
- Haemophilus: ArcA
ArcA
- E. coli homológ gén: OmpR
ArcB
P
O2
P
ArcAP
NarX/L és NarP/Q
- nitrát regulator
- NarX és NarQ: membrán szenzor kináz
- NarL és NarP: citoplazmatikus regulátor
- szignál: nitrát és nitrit
- nitrát metabolizmusra hat
- NarL és NarP különböző génekre
génexpresszió finom hangolása
különböző atás 
a
NarX
NO3
NarLP
P
NarQ
Kétkomponensű rendszerek
vége
NarPP
A lac operon kettős szabályozása
 laktóz (allolaktóz) indukál
 glükóz gátol, cAMP/CAP-n
keresztül

glükóz/egyéb cukor
kiiktatása tápból nem célszerű
  glükóz szabályozás
kikapcsolása
lac (és trp) alapú promóterek
erősség
trp
“-35”
“-10”
AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCA
tac
AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA
lacUV5
CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGA
lac
CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGGTGTGTGGA
UV
lacUV5  lac promóter
A transzkripciós faktorok sokoldalúak….
AraC
Ara C
-Ara
+Ara
PBAD represszió
PBAD indukció
PBAD
AraC
RNS polimeráz
PBAD
Transzkripció termináció baktériumokban
Rho független
Rho függő
a) Rho kötődik és üldözi a polimerázt
a) hurok képződés indul
b) hurok képződés indul
hibrid destabilizálódik
b) hurok képződés, polimeráz megáll
c) termináció
c) Rho helikáz felszabadítja a transzkriptet, termináció
A transzkripció és a transzláció párhuzamosan
megy baktériumokban
A triptofán operon szerkezete
protein
antranilát szintáz
indol-glicerin szintáz
triptofán szintáz
A triptofán operon szabályozása
Attenuáció-termináció – trp operon
E. coli-ban fehérje túltermeltetésre használt promóterek
mRNS degradáció baktériumokban
mRNS stabilitás
prokariótákban néhány perc,
eukariótákban órás nagyságrend
előbb utóbb minden RNS lebomlik
mRNS stabilitását meghatározó faktorok:
- belső, saját szerkezet
- a környezet hatására bekövetkezett változás
a degradációs apparátusban
puf operon (a fotoszintetikus komplex komponensei)
Rhodobacter capsulatus degradációja O2 hatására felgyorsul
policisztronos rendszerek esetén az alegységek arányának szabályozása
a mRNS régióinak eltérő stabilitásával
A R. capsulatus puf mRNS régióinak stabilitása
mRNS degradáció baktériumokban,
vizsgálati módszerek
- transzkripció gátlása (pl. rifampicin) t=0 időpontban,
majd  időközönként mintavétel és RNS analízis (Northern..)
- a degradációs mechanizmusban szerepet játszó gének deléciója,
hőmérséklet érzékeny expressziós változatának kialakítása
- in vitro transzkripció jelölt nukleotidokkal,
a kapott termék inkubációja a sejtextraktummal különböző ideig,
majd analízis gélelektroforézissel,
kvantitálás
mRNS-t stabilizáló-destabilizáló tényezők
Az 5’ végi struktúra stabilizáló hatása
a stabillizálódás a mRNS hurok struktúrájában van
nem csak a riboszóma véd,
a stabilizáló effektus átvihető más génekre
mRNS-eket stabilizáló (védő) tényezők
1.
5’ végi trifoszfát
2.
RNS struktúra
3.
riboszóma
A degradoszóma felépítése
Az RNaseE elsődleges felépítése
Érdekes módon sok bakteriális genomban nincs meg
A degradoszóma komponensei I.
Endoribonuclease E (RNáz E)
1061 aminosav  118 kDa fehérje, virtuálisan 180 kDa
(oka prolin gazdag régió)
felismerő hely:
(A/G)AUU(A/T)
vagy egy komplex másodlagos struktúra
5' monofoszfátot preferál 5' trifoszfát stabilizál
N-terminális régió (50 kDa): endoribonukleáz funkció
C-terminális: a degradoszóma egyéb komponenseire megfelelő kötő domének
A degradoszóma komponensei II.
PNPase (polynucleotide phosphorylase)




78 kDa alegységek, homotrimer
3'  5' foszfát függő processzív exonukleáz,
ribonukleotid difoszfátok képződnek
poliadenilációs aktivitás
Polyphosphate Kinase (PPK)

funkció:
ATP regeneráció,
polifoszfát (inhibiálja a degradációt) eltávolítás

ppk mínusz törzs : megnövekedett mRNS stabilitás

80 kDa alegységek, homotetramer, sok van E. coli-ban
A degradoszóma komponensei III.
Helikáz
ATP függő DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) helikáz
50 kDa RhlB
a másodlagos struktúrák kinyitása szétroncsolása
ATP hiányában a
hurokstruktúra
stabil marad
Egyéb – mRNS degradációjában résztvevő –
enzimek
RNáz II
70 kDa monomer,
a sejt 3'  5' exoribonukláz aktivitásának 90%-a
ribonukleotid monofoszfátok képződnek
a PNPáz-zal együttes deléciója letális !!!
PolyA polimerázok
PAPI
PAPII
53 kDa
35 kDa
poliadeniláció, 15- 50 bázis hosszú
mRNS instabilitás
A mRNS degradáció mechanizmusa
Transzláció prokariótákban
A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek
30S
30S* + mRNA
k1
30S*
( 30S + IF1, IF2, IF3, fMet-tRNSMet)
PK
( preiniciációs komplex)
IK
( iniciációs komplex)
k-1
PK
k2
k-2
IK
k3
TK
( transzlációs komplex)
K1 nagy, ha az SD és a rRNS közti kölcsönhatás erős.
k2 a SD és a transzlációs start kodon közti távolság,
és a régió másodlagos szerkezetének függvénye.
Shine - Dalgarno szekvencia
GGAGG a tökéletes komplementer a 16S rRNS 3'végéhez,
pl. GAAG GGAG mutáció (maltóz operon)
10 x növekedés a termék mennyiségében
a SD szekvencia hosszának növelése nem feltétlenül növeli a transzlációt
Hasonlóan a promóterekhez, túl erős kötődés a SD szekvencia
és a 16S rRNS 3’ vége között a transzlációt gátolhatja.
Transzlációs start kodon
kodon
gyakoriság
AUG
91 %
GUG
8%
UUG
1%
Az AUG előtti szekvenciák
20x-os különbség
UAU, CUU >> UUC, UCA, AGG ("-1 triplet)
G-k kerülendők
Az AUG utáni szekvenciák
30x -oskülönbségek lehetnek
AAA(Lys) > AAG(Lys) > UUU(Phe), AUC/A(Val), GUA(Ala)...
A természetes gének között is az AAA(Lys) és GCU(Ala)
transzlációs szabályozás a 2. kodonnal
+10 régió AT gazdag
Távolság a start kodon és a SD között
- meglehetősen érzékeny, általban 4 - 13 bázispár megengedett.
- Génfüggő, egy gén esetén általában csak kicsit változhat.
A köztes szekvencia összetétele
“A” jó, ha van (2x-es stimulus),
“C” mindegy
“U” a "-4"-es pozícióban hatékony
“G” gátol (3x-os gátlás)
Upstream nemtranszlálódó szekvencia
Nem nagyon vizsgált, de kell, mert eltávolítása megszünteti a transzlációt (ld lac).
Minimum 10 bp kell. Esetleg valamilyen faktorok kötődnek hozzá.
Kodon felhasználási preferencia
Bár a kodonok gyakorlatilag univerzálisak,
a különböző sejtféleségek különböző gyakorisággal használják
az azonos aminosavakat kódoló tripleteket.
Ha a termeltetendő fehérje génjének kodon használata
nagyon eltér a gazdasejtétől, akkor meg kell szintetizáltatni a gént
a gazda sejt preferenciájának megfelelően.
Alternatív megoldás: a gazdasejt kodon preferenciájának megváltoztatása,
ritka kodonokhoz tartozó tRNS gének bevitelével
Kodon felhasználási preferencia – táblázat
Sphingomonas paucimobilis
AmAcid
Codon
Gly
Gly
Gly
Gly
GGG
GGA
GGT
GGC
Glu
Glu
Asp
Asp
Number
/1000
Fraction
208.00
70.00
117.00
827.00
14.99
5.04
8.43
59.59
0.17
0.06
0.10
0.68
GAG
GAA
GAT
GAC
476.00
318.00
297.00
558.00
34.30
22.91
21.40
40.20
0.60
0.40
0.35
0.65
Val
Val
Val
Val
GTG
GTA
GTT
GTC
386.00
40.00
65.00
412.00
27.81
2.88
4.68
29.69
0.43
0.04
0.07
0.46
Ala
Ala
Ala
Ala
GCG
GCA
GCT
GCC
630.00
142.00
108.00
687.00
45.39
10.23
7.78
49.50
0.40
0.09
0.07
0.44
Arg
Arg
Ser
Ser
AGG
AGA
AGT
AGC
35.00
12.00
24.00
232.00
2.52
0.86
1.73
16.72
0.04
0.01
0.04
0.3
Lys
Lys
Asn
Asn
AAG
AAA
AAT
AAC
465.00
76.00
151.00
252.00
33.50
5.48
10.88
18.16
0.86
0.14
0.37
0.63
Met
Ile
Ile
Ile
Thr
Thr
Thr
Thr
Trp
End
Cys
Cys
End
End
Tyr
Tyr
Leu
Leu
Phe
Phe
Ser
ATG
ATA
ATT
ATC
ACG
ACA
ACT
ACC
TGG
TGA
TGT
TGC
TAG
TAA
TAT
TAC
TTG
TTA
TTT
TTC
TCG
376.00
19.00
117.00
570.00
228.00
29.00
41.00
383.00
250.00
37.00
21.00
167.00
5.00
8.00
213.00
170.00
71.00
4.00
86.00
542.00
204.00
27.09
1.37
8.43
41.07
16.43
2.09
2.95
27.60
18.01
2.67
1.51
12.03
0.10
0.58
15.35
12.25
5.12
0.29
6.20
39.05
14.70
[gbbct]: 50 CDS's (13879 codons)
egy adott gén esetén a kodon preferencia alapján a gén E. coli-ban,
vagy élesztőben való expresszálhatósága in silico becsülhető.
1.00
0.03
0.17
0.81
0.33
0.04
0.06
0.56
1.00
0.74
0.11
0.89
0.36
0.16
0.56
0.44
0.06
0.00
0.14
0.86
0.31
A transzláció terminációja
STOP kodon
kötődő faktor
UAA >> UGA, UAG
UAA
RF1, RF2
Az esetek 80 %-ában:
UAAU
UGA
RF1
UAG
RF2
PROTEOLÍZIS
Abnormális fehérjék proteolitikus lebontási mechanizmusa
E. coli-ban
Abnormális fehérjék,
sejten belüli aggregátumok
ATP függő
endoproteázok
polipeptidek
< 1500 Da
endoproteázok
peptidek
aminosavak
oldékony mono-, di- és
tripeptidázok
La (Lon) a fő ATP függő proteáz
 87 kDa egységekből felépülő homotetramer,
 ATP és Mg2+ függő, az ATP-áz aktivitás nem a polipeptid kötés
felbontásához, hanem a degradálandó fehérjén való végiglovagláshoz kell,
 in vitro 2 ATP/ peptidkötés, in vivo ez változhat, és ennél nagyobb.
 hasonló fehérjék előfordulnak magasabbrendűekben is, pl. egy máj
mitondriális proteáz immunológiailag keresztreaktív
 abnormális fehérjék, és rövid élettartamú (pl. szabályozó fehérjék bontása)
 szerin proteáz, hidrofób jellegű szekvenciáknál hasít
 alapállapotban inaktív, a szubsztrát fehérje hozzákapcsolódása aktiválja,
 a lon gén terméke, és a sokk fehérjékhez kapcsolódó szabályozás alatt áll:
32 faktor, ami a htpR (rpoH) gén terméke
A proteolitikus ciklus
inaktív proteáz
(4 ADP)
protein
szubsztrát
4 ADP
4 PO434 Mg 2+
4 ATP - Mg2+
aktív proteáz
(4 ATP)
alloszterikus aktiválás
Genetikai vonatkozások
léteznek inszerciós, deléciós lon mutánsok
A lon- mutáció másodlagos hatásai
Poliszaharid burok képzés (főleg alacsonyabb hőmérsékleten, mint 34oC)
Megoldás:
37oC-on növeszteni
 galE struktúrgének inaktiválása
 cps (capsule) struktúrgének inaktiválása
 rcsB, rcsA szabályozó régió mutánsok
A lon mutánsok UV érzékenyek
DNS sérülés  filamentáció
Gazdag médiumon akár letális is lehet
ok: SOS indukálható sejtosztódás inhibitor SulA.
Megoldás:
- ne használjunk yeast extraktot, hanem tryptont
- sulA mutánsok
Ti (Clp) a másik ATP függő proteáz
 81 (ClpA) és 21 kDa (ClpP) alegységekből álló heterodimer,
ez multimerizálódik, a natív enzim kb 700 kDa móltömegű
 ATP és Mg2+ faktorok szükségesek
hidrofób részeknél hasít, de a specificitás eltér a La-tól
 az alegységek külön multimerizálódnak
 HtpR szabályozás alatt áll
Tulajdonság
Ti (Clp) proteáz
ClpP
ClpA
aktivitás
fehérje degradáció
ATP hidrolízis mellett
peptidáz
ATP független
ATP-áz
fehérje aktivált
Kofaktor
Mg2+
-
Mg2+
Inhibítor
MalNEt, iPr2P-F
iPr2P-F
MalNEt
Stabilizálás
ATP, glicerin
hőstabil
ATP, glicerin
natív méret
700 kDa
260 kDa
160 kDa
alegységek
6 ClpA + 12 ClpP
21 kDa
81 kDa
Genetikai vonatkozások
 Rendelkezésre állnak clp mutánsok
 a mutáns egyedül nem, de a lon- nal együtt hatékony
Egyéb proteázok
OmpT külső membránhoz kapcsolódó proteáz
DegP periplazmatikus proteáz
T4 fág fertőzés stabilizálja a fehérjéket
pin gén terméke: La inhibitor
Példák proteázaikban mutáns E. coli törzsekre
E. coli törzs
genotípus
Kiindulási törzs
Megjegyzés
lon mutánsok
SG1117
gal lac lon-146::Tn10 leu
sup+ rec+
HB101
Tetraciklin
rezisztens, jól
transzformálható
SG12041
gal, lon-510 sulA recA
C600
nincs filamentáció
Rec-
MC4100
hőmérséklet
érzékeny
C600
kanamycin
rezisztens
lon htpR mutánsok
SG21163
lon-510 supFts htpRam165
lon clp mutánsok
SG12044
gal lon-510 sulA
clpA319::kan
lon clp htpR mutánsok
SG21173
lon-510 supFts htpRam165
clpA319::kan lac
MC4100
kanamycin
rezisztens,
hőmérséklet
érzékeny
FÚZIÓS FEHÉRJÉK
A fúziót gén szinten hozzuk létre úgy, hogy a fúziós partnerek génjeit
a megfelelő leolvasási keretben úgy klónozzuk össze,
hogy az 5’ vég felőli génhez tartozó transzlációs stop kodon ne szerepeljen.
Így egy polipeptidláncot kapunk, amelyben a kiinduási fehérjék egymást
követő régiókként helyezkednek el.
ELŐNYEI
1.
Kis peptidek esetén a fúzió proteolitikus stabilitást jelenthet
2.
Óriási előny a tisztítás során, affinitás oszlopok
3.
szignálpeptiddel való fúzió, szekretált fehérje (limitált)
4.
Az in vitro hasítás sokszor pontosabb,
intaktabb N-terminális szekvenciát eredményez
Fúziós fehérjék oldhatósága
Oldhatatlan
Oldható forma
"iclusion bodies"
trpEII, vagy cII,
nincs proteolízis, differenciális centrifugálással
az "inclusion body" könnyen tisztítható,
probléma: nem aktív fehérje
pl sometostatin, inzulin A, B,
ellenanyag termelés
biológiailag aktív fehérje,
affinitás oszlopon való tisztítás
problémák a stabilitással,
kevésbé jósolható
Egyéb hasznosítási lehetőségek
1. a szignál peptidekkel való fúzió előnyei (ld. később)
a periplazmában, illetve az extracelluláris térben oxidatívabb környezet,
diszulfid hidak kialakulása, pl. EGF, IGF
A periplazmában az összfehérje 4%-a található, értelemszerűen
kevesebb proteáz,könnyebb tisztítás
2.
A fúzionált fehérje linkerként szolgál, és így a kívánt fehérje immobilizálható
3.
funkcionális, struktúrális vizsgálatok, pl. immunológiai felhasználás
alkalmasan választott fúziós partner esetén nincs szükség hasításra.
A fúziós fehérjék tisztításának elve
fúziós partner
célfehérje
I. 1. affinitás kromatográfia
II. hasítás
III. 2. affinitás kromatográfia
tiszta fehérje
A fúziós fehérjék típusai I.
I. Szekréció
P
S
Megjegyzés
pl. humán növekedési hormon
alkalikus foszfatáz szignál
szekvenciával
T
X
II. Polimerizáció
P
T
X
X
III. C-terminális fúzió
P
T
A
X
IV. N-terminális fúzió
P
T
X
B
fehérje-élettartam növekedés,
pl. proinzulin 1-2 percről 60 perc,
IGF 200x-os növekedés
a fúziós partner intakt
szabályozó régiója használható,
pontosabb proteolitikus hasítás
amino terminális szekvenciák
meghatározása,
a proteolititkus hasítás csonkot
hagyhat a “B” N-terminálisán
A fúziós fehérjék típusai II.
V. A szekréció és a C-terminális fúzió kombinációja
P
T
S
A
a termék folyamatosan kinyerhető
affinitáskromatográfiával
X
VI. Kettős fúzió
P
T
A
X
B
P
T
A
B
X
P
T
X
A
B
nagy tisztaságú,
nagy stabilitású termék,
hátrány:
két tisztítás, hasítás
szükséges
VII. Szekréció-inszerció
P
T
S
X
I
membrán fehérjék
termeltetése
a membránban
Fúziós partnerfehérjék
Fehérje
Származási hely
molekulasúly (kDa)
szekréció
ligand
-galaktozidáz
Escherichia coli
116
-
TPEG, APTG
Protein A
Staphylococcus aureus
31
+
IgG
Z
szintetikus
7
+
IgG
CAT
Escherichia coli
24
+
klóramfenikol
sztreptavidin
Streptomyces
13
+
biotin
PhoS
Escherichia coli
36
+
hidroxilapatit
Protein G
Streptococci
28
+
albumin
MBP
Escherichia coli
40
+
keményítô
GST
Escherichia coli
26
-
glutation
poliarginin
szintetikus
1-3
-
ioncsere
poliglutamát
szintetikus
1-2
-
ioncsere
polihisztidin
szintetikus
1-7
+
Ni2+, Zn2+, Cu2+
CAT: klóramfenikol-acetiltranszferáz; Z: A Protein A fehérje IgG kötô doménje;
PhoS: foszfát kötô fehérje; MBP: maltóz-kötô fehérje; GST: glutation S-transzferáz;
TPEG: p-aminofenil--d-tiogalaktozidáz; APTG: p-aminofenil--d-tiogalaktozid.
FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI I.
KÉMIAI
hasító ágens
brómcián
hasítási hely
- Met

hangyasav
- Asp  Pro -
hidroxilamin
- Asn  Gly -
ENZIMATIKUS
aminopeptidázok
1 - 3 aminosavat hasítanak az N-terminálisról
karboxipeptidázok
1 - 2 aminosavat hasítanak a C-terminálisról
FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI II.
ENZIMATIKUS
Endopeptidázok
ENZIM
HASÍTÁSI HELY
kollagenáz
- Pro - Val  Gly - Pro -
enterokináz
- Asp - Asp - Asp - Lys 
Xa faktor
- Ile - Glu - Gly - Arg 
trombin
- Gly - Pro - Arg 
tripszin
- Arg, Lys 
klosztripain
- Arg 
Ala64-szubtilizin
- Gly - Ala - His - Arg 
A fehérje szekréció
Nómenklatúra:
szekréció: az extracelluláris térbe
export: az sejtmembránokba vagy a periplazmatikus térbe
Előnyei
 A tisztítás sokkal egyszerűbb, esetleg folyamatos üzemű lehet
 Az periplazma illetve az extracelluláris tér sokkal oxidatívabb,
korrektebb protein folding
 A fehérje degradáció sokkal csekélyebb mértékű, proteolitikusan
stabilabb termékek
Baktériumok membránszerkezete
SZEKRÉCIÓ E. coli-ban
 nem hatékony vagy nem teljes transzport a membránon keresztül
 alacsony transzport-kapacitás, stresszválasz, idő előtti fehérjedegradáció
 ha a transzporthoz a fehérje poszttranszlációs módosítása szükséges,
akkor ennek hiánya
kis molekulákra, mint növekedési faktorok vannak jó eredmények
nagy molekulák esetén problémák lehetnek,
pl az ER hiánya (módosítások színhelye)
vannak fehérjék, amelyek nem szekretálhatóak,
esetleg letális, pl -galaktozidáz fúziós fehérjék exportja
Fő protein transzport mechanizmusok
baktériumokban
Kotranszlációs transzport
SRP, signal recognition particle, és receptora
E. coli homológ: Ffh forty five homolog, FtsY
Poszttranszlációs transzport
Sec útvonal:
egyszerű kofaktor mentes polipeptidekre
Tat útvonal:
több alegységes enzimekre, amelyek kofaktorokat is
tartalmaz(hat)nak
transzport: a fehérje összeszerelődése után
Sec útvonal E. coli-ban
- szignál szekvencia,
- szignál peptidázok, szignál peptidázI (lep), Ala-X-Ala felismerőhely
- szignál peptidázII (lsp), szignál szekvenciák eltávolítása lipoproteinekrôl
- sec A, B, D, E, Y gének mutációja a prekurzorok felhalmozódásához vezet,
Némi átfedés van közöttük.
- Régebben prl nómenklatúra is volt
- SecA, 102 kDa, citoplazmatikus, és belső membránkötött, ATP-áz aktivitás,
kölcsönhatás a szállítandó fehérjével
- SecB szekréció kompetens konformációért felelős
- SecYEFG a csatorna kialakításáért felelős
- SecD a periplazmatikus térbe való “leválásért”
SZIGNÁL SZEKVENCIÁK GRAM- BAKTÉRIUMOKBAN I.
Standard szignál peptid
hasítóhely
“N”
1
K vagy R
“H”
“C”
hidrofób  hélix, sok A és
L,
nem lehet P, K, R, D, E, H, R
fordula
t
P
G
A
V
S
-3
f
M
G
fordula
t
A
G
S
semleges
vagy
negatív
COOH
-1 +1
A
X
Lipoprotein szignál peptid
“N”
1
K vagy R
hasítóhely
“C”
“H”
hidrofób  hélix, sok A és L,
nem lehet P, K, R, D, E, H, R
L
A
G
semleges
vagy
negatív
-1 +1
fM
D
lipoprotein kiválasztó
szignál
COOH
SZIGNÁL SZEKVENCIÁK II.
Gram-pozítív baktériumok
 a szignál peptid szignifikánsan hosszabb
 kiterjedtebb “H” régió
Eukarióták
 a “H” régióban a Leu dominál
 nem olyan szigorú a (-1, -3) szabály
 a hasítóhely után nincs kitüntetett aminosav
az eukarióta szekretált fehérjéket az E. coli export mechanizmusa
felismer(het)i, illetve fordítva
A Sec függő fehérje transzlokáció
modellje E. coli-ban
INICIÁCIÓ
TRANSZLOKÁCIÓ
KISZABADULÁS
periplazma
SPáz
H+
Y
E
Y
G
A
citoplazma
D
G
A
ATP
ADP+Pi
E
H+
B
citoplazma
Y
A
AT
P
ADP+Pi
C
N
N+
C+
Átjutás a C-terminális
véggel,
ez az áltatános
Átjutás az N-terminális
véggel,
inszerció
E
G
A Sec útvonal - másképpen
A Sec útvonal - másképpen
A prokarióta és eukarióta transzportmechanizmusok
összehasonlítása
Az SRP (Ffh-FtsY) útvonal
membrán fehérjékre jellemző
A Sec és az SRP közötti választás: “trigger” faktor
Signal sequences for targeting
Sec szignál peptid
+
N
n-region
erősen
hidrofób
h-region
c-region
SRP: erősen hidrofób szignál, nem hasad le
Twin-arginine szignál peptid
S/T-R-R-x-F-L-K
n-régió
h-régió
+
N
moderáltan
hidrofób
c-régió
A periplazmatikus hidrogenázok bioszintézise
citoplazmatikus összeszerelődési modell
Holoenzim
Periplazma
csatorna
Citoplazma
szignál peptid
prekurzor
kofaktor(ok)
A TAT modell I.
The twin-arginine translocase (Tat) proteins
periplazma
N
N
N
membrán
C
TatA
C
TatB
TatE
N
C
citoplazma
TatC
C
A TAT modell II.
membrán
TatB
TatC
TatA
citoplazma
aktív formát felvett enzim
Rekombináns fehérjék termeltetési stratégiái
Két fő stratégia:
 Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo előfordul,
szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakuljanak
 ha a fehérje mérgező a gazdasejtre, akkor először inaktív fehérjét állítunk elő,
majd ezt aktiváljuk, ehhez kell az in vitro “refolding”
Az aktív forma esetén “csak” tisztítani kell a fehérjét
REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK AKTÍV FORMÁBA VITELE
Három fő lépés:
1. Az oldhatatlan “inclusion body”-t szolubilizáljuk,
alacsony vagy magas pH, emelt hőmérséklet, detergensek, magas koncentrációjú
szervetlen sók, vagy szerves oldószerek.
A legelterjedtebbek: urea, vagy guanidin-hidroklorid,
esetleg redukálószer (pl. DTT) jelenlétében.
2. Refolding
híg fehérje oldattal
- ha nincs diszulfid híd, akkor a fehérje denaturálószer lassú eltávolítása
- ha diszulfid hidak vannak, akkor a renaturáció mellett
a diszulfid hidakat is ki kell alakítani, szerkezet stabilizáló hatásuk van.
levegőztetés, tiol-diszulfid párok hozzáadása,
pH optimalizálása
3. Az aktív és inaktív forma szétválasztása
pl. affinittás kromatográfia, preparatív natív PAGE, RP-HPLC, FPLC stb.
T7 RNS polimeráz alapú vektorok
- T7 promoter nagyon szelektív, a gazdában nincs ilyen promoter általában
- T7 RNS polimeráz 5x gyorsabb, mint az E. coli-é, azaz már a transzkript is domináns
Gazdasejtek:
Standard klónozó vektorok klónozásra
BL21 (F-, ompT-, lon-) expresszióra,
lizogén sejtváltozatok: DE3 bakteriofág, immunitási régió, lacI gén,
lacUV5 promoter lacZ eleje + T7 RNS polimeráz génje, integrálva kromoszómába
Nagyon toxikus fehérjék esetén
pLysS, pLysE
T7 lizozim: természetes inhibitora a T7 RNS polimeráznak,
E. coli tudja tolerálni, mert nem képes áthatolni a belső membránon
pACYC184 vektorba van beépítve, catr, kompatibilis vektor
pLysE nagy mennyiséget,
pLysS kevesebb mennyiséget termel (ellentétes orientáció, tet promoter
CE6 bakteriofág
tartalmazza a T7 RNS polimeráz génjét, így az indukció kívülről bejuttatott gén
A pET vektorokon alapuló, indukálható
fehérje termelés elvi sémája
kromoszóma
int
lacI
lacUV5 lac
Z
10
vagy
T7/
lac
Prom.RBS
T7 RNS polimeráz
int
termeltetendõ fehérje génje
vektor
bla
OR
I
A pET rendszer
pET vektorok
 pBR322 származékok,
 ampicillin, vagy kanamicin rezisztensek
 10 promoter, a T7 fág 10-es génjének (kapszid) erős promótere
1. Transzkripciós vektorok
T7 promoter van, de nincs transzlációs iniciációs szignál
különféle verziók,
stop szignálok bevitele vagy sem, fúziós partner esetleg a C terminálison
Visszaszorulóban vannak
T7lac promoteres változatok
Nagyon toxikus fehérjék esetén dupla biztosítás:
a T7 promotertől startpont környékére a lac operátor szekvencia klónozása,
elegendő lacI biztosítása, a vektorba beépítették ellentétes irányban
Két transzkripciós vektor példa
Transzlációs vektorok
  10 transzkripciós és transzlációs szignálok,
 mindegyik típusú egy sorozat
különböző leolvasási keretekkel
 Egy rövid fúzió az első 10 aminosavval (g10),
de NdeI-gyel elkerülhető.
 Esetenként  206aa fúzió  stabilitás
Arabinóz alapú expressziós vektorok
Szabályozás
Vektor felépítés
Szekréciós vektor
Kontrollálhatóság
Fehérje termeltetés in vitro
In vitro transzláció
Előnyei:
Oxidatív környezet
Citotoxicitás elkerülése, farmakológiai alkalmazások
Nincs membrán, a termék azonnal a reaktortérbe kerül
gyors
Hátrányai:
 Drága
 Kitermelés korlátozott
Két fő stratégia
RNS polimerázzal
+sejt extraktummal
Tiszta komponensekből
Az in vitro fehérjetermeltetés folyamatábrája
T7 alapú rendszerek
Az igazán in vitro rendszer