Transcript fúziós fehérjék

Transzláció prokariótákban
A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek
30S
30S* + mRNA
k1
30S*
( 30S + IF1, IF2, IF3, fMet-tRNSMet)
PK
( preiniciációs komplex)
IK
( iniciációs komplex)
k-1
PK
k2
k-2
IK
k3
TK
( transzlációs komplex)
K1 nagy, ha az SD és a rRNS közti kölcsönhatás erős.
k2 a SD és a transzlációs start kodon közti távolság,
és a régió másodlagos szerkezetének függvénye.
A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek
technikai megközelítés
Shine - Dalgarno szekvencia
GGAGG a tökéletes komplementer a 16S rRNS 3'végéhez,
pl. GAAG GGAG mutáció (maltóz operon)
10 x növekedés a termék mennyiségében
a SD szekvencia hosszának növelése nem feltétlenül növeli a transzlációt
Hasonlóan a promóterekhez, túl erős kötődés a SD szekvencia
és a 16S rRNS 3’ vége között a transzlációt gátolhatja.
Transzlációs start kodon
kodon
gyakoriság
AUG
91 %
GUG
8%
UUG
1%
Az AUG előtti szekvenciák
20x-os különbség
UAU, CUU >> UUC, UCA, AGG ("-1 triplet)
G-k kerülendők
Az AUG utáni szekvenciák
30x -oskülönbségek lehetnek
AAA(Lys) > AAG(Lys) > UUU(Phe), AUC/A(Val), GUA(Ala)...
A természetes gének között is az AAA(Lys) és GCU(Ala)
transzlációs szabályozás a 2. kodonnal
+10 régió AT gazdag
Távolság a start kodon és a SD között
- meglehetősen érzékeny, általban 4 - 13 bázispár megengedett.
- Génfüggő, egy gén esetén általában csak kicsit változhat.
A köztes szekvencia összetétele
“A” jó, ha van (2x-es stimulus),
“C” mindegy
“U” a "-4"-es pozícióban hatékony
“G” gátol (3x-os gátlás)
Upstream nemtranszlálódó szekvencia
Nem nagyon vizsgált, de kell, mert eltávolítása megszünteti a transzlációt (ld lac).
Minimum 10 bp kell. Esetleg valamilyen faktorok kötődnek hozzá.
Kodon felhasználási preferencia
Bár a kodonok gyakorlatilag univerzálisak,
a különböző sejtféleségek különböző gyakorisággal használják
az azonos aminosavakat kódoló tripleteket.
Ha a termeltetendő fehérje génjének kodon használata
nagyon eltér a gazdasejtétől, akkor meg kell szintetizáltatni a gént
a gazda sejt preferenciájának megfelelően.
Alternatív megoldás: a gazdasejt kodon preferenciájának megváltoztatása,
ritka kodonokhoz tartozó tRNS gének bevitelével
Kodon felhasználási preferencia – táblázat
Sphingomonas paucimobilis
AmAcid
Codon
Gly
Gly
Gly
Gly
GGG
GGA
GGT
GGC
Glu
Glu
Asp
Asp
Number
/1000
Fraction
208.00
70.00
117.00
827.00
14.99
5.04
8.43
59.59
0.17
0.06
0.10
0.68
GAG
GAA
GAT
GAC
476.00
318.00
297.00
558.00
34.30
22.91
21.40
40.20
0.60
0.40
0.35
0.65
Val
Val
Val
Val
GTG
GTA
GTT
GTC
386.00
40.00
65.00
412.00
27.81
2.88
4.68
29.69
0.43
0.04
0.07
0.46
Ala
Ala
Ala
Ala
GCG
GCA
GCT
GCC
630.00
142.00
108.00
687.00
45.39
10.23
7.78
49.50
0.40
0.09
0.07
0.44
Arg
Arg
Ser
Ser
AGG
AGA
AGT
AGC
35.00
12.00
24.00
232.00
2.52
0.86
1.73
16.72
0.04
0.01
0.04
0.3
Lys
Lys
Asn
Asn
AAG
AAA
AAT
AAC
465.00
76.00
151.00
252.00
33.50
5.48
10.88
18.16
0.86
0.14
0.37
0.63
Met
Ile
Ile
Ile
Thr
Thr
Thr
Thr
Trp
End
Cys
Cys
End
End
Tyr
Tyr
Leu
Leu
Phe
Phe
Ser
ATG
ATA
ATT
ATC
ACG
ACA
ACT
ACC
TGG
TGA
TGT
TGC
TAG
TAA
TAT
TAC
TTG
TTA
TTT
TTC
TCG
376.00
19.00
117.00
570.00
228.00
29.00
41.00
383.00
250.00
37.00
21.00
167.00
5.00
8.00
213.00
170.00
71.00
4.00
86.00
542.00
204.00
27.09
1.37
8.43
41.07
16.43
2.09
2.95
27.60
18.01
2.67
1.51
12.03
0.10
0.58
15.35
12.25
5.12
0.29
6.20
39.05
14.70
[gbbct]: 50 CDS's (13879 codons)
egy adott gén esetén a kodon preferencia alapján a gén E. coli-ban,
vagy élesztőben való expresszálhatósága in silico becsülhető.
1.00
0.03
0.17
0.81
0.33
0.04
0.06
0.56
1.00
0.74
0.11
0.89
0.36
0.16
0.56
0.44
0.06
0.00
0.14
0.86
0.31
STOP kodon
STOP kodon
kötődő faktor
UAA >> UGA, UAG
UAA
RF1, RF2
Az esetek 80 %-ában:
UAAU
UGA
RF1
UAG
RF2
KÉT CISZTRONOS EXPRESSZIÓS RENDSZER
1 Cisztronos rendszer
SD
5’
mRNS
ATG
struktúrgén
2 Cisztronos rendszer
1. SD
5’
3’
termeltetendő fehérje
1. STOP
ATG
mRNS
STOP
1. cisztron
2. SD
ATG
3’
2. cisztron
2. STOP
Az 1. cisztron tetszőlegesen tervezhetú, de:
- ne legyen túl hosszú, hogy ne terhelje feleslegesen a sejtet
(felesleges műtermék) néhány aminosav
- AT gazdag legyen a másodlagos struktúrák elkerülése végett.
1 Cisztronos rendszer
SD
5’
mRNS
ATG
struktúrgén
2 Cisztronos rendszer
1. SD
5’
3’
termeltetendő fehérje
1. STOP
ATG
mRNS
STOP
1. cisztron
ATG
3’
2. cisztron
2. SD
2. STOP
Az 1. cisztron STOP kodon pozíciója a 2. cisztron
Shine-Dalgarno szekvenciájához
képest meghatározó a transzláció hatékonysága szempontjából.
PÉLDA bGH (marha növekedési hormon)
Egy cisztronos rendszerben < 0.4 % fehérje
Két cisztronos rendszerben
1. cisztron ...GGAGGAATAACATATG...2. cisztron.
elrendeződésben 24 % fehérje termeltethető
Kifordított – antiriboszómális kötőhelyen alapuló - rendszer
PROTEOLÍZIS
Abnormális fehérjék proteolitikus lebontási mechanizmusa
E. coli-ban
Abnormális fehérjék,
sejten belüli aggregátumok
ATP függő
endoproteázok
polipeptidek
< 1500 Da
endoproteázok
peptidek
aminosavak
oldékony mono-, di- és
tripeptidázok
La (Lon) a fő ATP függő proteáz
 87 kDa egységekből felépülő homotetramer,
 ATP és Mg2+ függő, az ATP-áz aktivitás nem a polipeptid kötés
felbontásához, hanem a degradálandó fehérjén való végiglovagláshoz kell,
 in vitro 2 ATP/ peptidkötés, in vivo ez változhat, és ennél nagyobb.
 hasonló fehérjék előfordulnak magasabbrendűekben is, pl. egy máj
mitondriális proteáz immunológiailag keresztreaktív
 abnormális fehérjék, és rövid élettartamú (pl. szabályozó fehérjék bontása)
 szerin proteáz, hidrofób jellegű szekvenciáknál hasít
 alapállapotban inaktív, a szubsztrát fehérje hozzákapcsolódása aktiválja,
 a lon gén terméke, és a sokk fehérjékhez kapcsolódó szabályozás alatt áll:
32 faktor, ami a htpR (rpoH) gén terméke
Proteolitikus ciklus
inaktív proteáz
(4 ADP)
protein
szubsztrát
4 ADP
4 PO434 Mg 2+
4 ATP - Mg2+
aktív proteáz
(4 ATP)
alloszterikus aktiválás
Genetikai vonatkozások
léteznek inszerciós, deléciós lon mutánsok
A lon- mutáció másodlagos hatásai
Poliszaharid burok képzés (főleg alacsonyabb hőmérsékleten, mint 34oC)
Megoldás:
37oC-on növeszteni
 galE struktúrgének inaktiválása
 cps (capsule) struktúrgének inaktiválása
 rcsB, rcsA szabályozó régió mutánsok
A lon mutánsok UV érzékenyek
DNS sérülés  filamentáció
Gazdag médiumon akár letális is lehet
ok: SOS indukálható sejtosztódás inhibitor SulA.
Megoldás:
- ne használjunk yeast extraktot, hanem tryptont
- sulA mutánsok
Ti (Clp) a másik ATP függő proteáz
 81 (ClpA) és 21 kDa (ClpP) alegységekből álló heterodimer,
ez multimerizálódik, a natív enzim kb 700 kDa móltömegű
 ATP és Mg2+ faktorok szükségesek
hidrofób részeknél hasít, de a specificitás eltér a La-tól
 az alegységek külön multimerizálódnak
 HtpR szabályozás alatt áll
Tulajdonság
Ti (Clp) proteáz
ClpP
ClpA
aktivitás
fehérje degradáció
ATP hidrolízis mellett
peptidáz
ATP független
ATP-áz
fehérje aktivált
Kofaktor
Mg2+
-
Mg2+
Inhibítor
MalNEt, iPr2P-F
iPr2P-F
MalNEt
Stabilizálás
ATP, glicerin
hőstabil
ATP, glicerin
natív méret
700 kDa
260 kDa
160 kDa
alegységek
6 ClpA + 12 ClpP
21 kDa
81 kDa
Genetikai vonatkozások
 Rendelkezésre állnak clp mutánsok
 a mutáns egyedül nem, de a lon- nal együtt hatékony
Egyéb proteázok
OmpT külső membránhoz kapcsolódó proteáz
DegP periplazmatikus proteáz
T4 fág fertőzés stabilizálja a fehérjéket
pin gén terméke: La inhibitor
Példák proteázaikban mutáns E. coli törzsekre
E. coli törzs
genotípus
Kiindulási törzs
Megjegyzés
lon mutánsok
SG1117
SG12041
Dgal Dlac lon-146::DTn10 leu
HB101
Tetraciklin
rezisztens, jól
transzformálható
Dgal, Dlon-510 sulA recA
C600
nincs filamentáció
Rec-
MC4100
hőmérséklet
érzékeny
C600
kanamycin
rezisztens
MC4100
kanamycin
rezisztens,
hőmérséklet
érzékeny
sup+ rec+
lon htpR mutánsok
SG21163
Dlon-510 supFts htpRam165
lon clp mutánsok
SG12044
Dgal Dlon-510 sulA
clpA319::Dkan
lon clp htpR mutánsok
SG21173
Dlon-510 supFts htpRam165
DclpA319::Dkan Dlac
FÚZIÓS FEHÉRJÉK
A fúziót gén szinten hozzuk létre úgy, hogy a fúziós partnerek génjeit
a megfelelő leolvasási keretben úgy klónozzuk össze,
hogy az 5’ vég felőli génhez tartozó transzlációs stop kodon ne szerepeljen.
Így egy polipeptidláncot kapunk, amelyben a kiinduási fehérjék egymást
követő régiókként helyezkednek el.
ELŐNYEI
1.
Kis peptidek esetén a fúzió proteolitikus stabilitást jelenthet
2.
Óriási előny a tisztítás során, affinitás oszlopok
3.
szignálpeptiddel való fúzió, szekretált fehérje (limitált)
4.
Az in vitro hasítás sokszor pontosabb,
intaktabb N-terminális szekvenciát eredményez
Fúziós fehérjék oldhatósága
Oldhatatlan
Oldható forma
"iclusion bodies"
trpEII, vagy cII,
nincs proteolízis, differenciális centrifugálással
az "inclusion body" könnyen tisztítható,
probléma: nem aktív fehérje
pl sometostatin, inzulin A, B,
ellenanyag termelés
biológiailag aktív fehérje,
affinitás oszlopon való tisztítás
problémák a stabilitással,
kevésbé jósolható
Egyéb hasznosítási lehetőségek
1. a szignál peptidekkel való fúzió előnyei (ld. később)
a periplazmában, illetve az extracelluláris térben oxidatívabb környezet,
diszulfid hidak kialakulása, pl. EGF, IGF
A periplazmában az összfehérje 4%-a található, értelemszerűen
kevesebb proteáz,könnyebb tisztítás
2.
A fúzionált fehérje linkerként szolgál, és így a kívánt fehérje immobilizálható
3.
funkcionális, struktúrális vizsgálatok, pl. immunológiai felhasználás
alkalmasan választott fúziós partner esetén nincs szükség hasításra.
4.
megfelelő hasítás után az intakt fehérje tetszőleges biokémiai, biofizikai
vizsgálata
A fúziós fehérjék tisztításának elve
fúziós partner
célfehérje
I. 1. affinitás kromatográfia
II. hasítás
III. 2. affinitás kromatográfia
tiszta fehérje
A fúziós fehérjék típusai I.
I. Szekréció
P
S
Megjegyzés
pl. humán növekedési hormon
alkalikus foszfatáz szignál
szekvenciával
T
X
II. Polimerizáció
P
T
X
X
III. C-terminális fúzió
P
T
A
X
IV. N-terminális fúzió
P
T
X
B
fehérje-élettartam növekedés,
pl. proinzulin 1-2 percről 60 perc,
IGF 200x-os növekedés
a fúziós partner intakt
szabályozó régiója használható,
pontosabb proteolitikus hasítás
amino terminális szekvenciák
meghatározása,
a proteolititkus hasítás csonkot
hagyhat a “B” N-terminálisán
A fúziós fehérjék típusai II.
V. A szekréció és a C-terminális fúzió kombinációja
P
T
S
A
a termék folyamatosan kinyerhető
affinitáskromatográfiával
X
VI. Kettős fúzió
P
T
A
X
B
P
T
A
B
X
P
T
X
A
B
nagy tisztaságú,
nagy stabilitású termék,
hátrány:
két tisztítás, hasítás
szükséges
VII. Szekréció-inszerció
P
T
S
X
I
membrán fehérjék
termeltetése
a membránban
Fúziós partnerfehérjék
Fehérje
Származási hely
molekulasúly (kDa)
szekréció
ligand
b-galaktozidáz
Escherichia coli
116
-
TPEG, APTG
Protein A
Staphylococcus aureus
31
+
IgG
Z
szintetikus
7
+
IgG
CAT
Escherichia coli
24
+
klóramfenikol
sztreptavidin
Streptomyces
13
+
biotin
PhoS
Escherichia coli
36
+
hidroxilapatit
Protein G
Streptococci
28
+
albumin
MBP
Escherichia coli
40
+
keményítô
GST
Escherichia coli
26
-
glutation
poliarginin
szintetikus
1-3
-
ioncsere
poliglutamát
szintetikus
1-2
-
ioncsere
polihisztidin
szintetikus
1-7
+
Ni2+, Zn2+, Cu2+
CAT: klóramfenikol-acetiltranszferáz; Z: A Protein A fehérje IgG kötô doménje;
PhoS: foszfát kötô fehérje; MBP: maltóz-kötô fehérje; GST: glutation S-transzferáz;
TPEG: p-aminofenil--d-tiogalaktozidáz; APTG: p-aminofenil--d-tiogalaktozid.
FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI I.
KÉMIAI
hasító ágens
brómcián
hangyasav
hidroxilamin
hasítási hely
- Met
- Asp


Pro -
- Asn  Gly -
ENZIMATIKUS
aminopeptidázok
1 - 3 aminosavat hasítanak az N-terminálisról
karboxipeptidázok
1 - 2 aminosavat hasítanak a C-terminálisról
FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI II.
ENZIMATIKUS
Endopeptidázok
ENZIM
HASÍTÁSI HELY
kollagenáz
- Pro - Val  Gly - Pro -
enterokináz
- Asp - Asp - Asp - Lys 
Xa faktor
- Ile - Glu - Gly - Arg 
trombin
- Gly - Pro - Arg 
tripszin
- Arg, Lys 
klosztripain
- Arg 
Ala64-szubtilizin
- Gly - Ala - His - Arg 
A fehérje szekréció
Nómenklatúra:
szekréció: az extracelluláris térbe
export: az sejtmembránokba vagy a periplazmatikus térbe
Előnyei
 A tisztítás sokkal egyszerűbb, esetleg folyamatos üzemű lehet
 Az periplazma illetve az extracelluláris tér sokkal oxidatívabb,
korrektebb protein folding
 A fehérje degradáció sokkal csekélyebb mértékű, proteolitikusan
stabilabb termékek
Baktériumok membránszerkezete
SZEKRÉCIÓ E. coli-ban
 nem hatékony vagy nem teljes transzport a membránon keresztül
 alacsony transzport-kapacitás, stresszválasz, idő előtti fehérjedegradáció
 ha a transzporthoz a fehérje poszttranszlációs módosítása szükséges,
akkor ennek hiánya
kis molekulákra, mint növekedési faktorok vannak jó eredmények
nagy molekulák esetén problémák lehetnek,
pl az ER hiánya (módosítások színhelye)
vannak fehérjék, amelyek nem szekretálhatóak,
esetleg letális, pl -galaktozidáz fúziós fehérjék exportja
Fő protein transzport mechanizmusok bacteriumokban
Kotranszlációs transzport
SRP, signal recognition particle, és receptora
E. coli homológ: Ffh forty five homolog, FtsY
Poszttranszlációs transzport
Sec útvonal:
egyszerű kofaktor mentes polipeptidekre
Tat útvonal:
több alegységes enzimekre, amelyek kofaktorokat is
tartalmaz(hat)nak
transzport: a fehérje összeszerelődése után
Sec útvonal E. coli-ban
- szignál szekvencia,
- szignál peptidázok, szignál peptidázI (lep), Ala-X-Ala felismerőhely
- szignál peptidázII (lsp), szignál szekvenciák eltávolítása lipoproteinekrôl
- sec A, B, D, E, Y gének mutációja a prekurzorok felhalmozódásához vezet,
Némi átfedés van közöttük.
- Régebben prl nómenklatúra is volt
- SecA, 102 kDa, citoplazmatikus, és belső membránkötött, ATP-áz aktivitás,
kölcsönhatás a szállítandó fehérjével
- SecB szekréció kompetens konformációért felelős
- SecYEFG a csatorna kialakításáért felelős
- SecD a periplazmatikus térbe való “leválásért”
SZIGNÁL SZEKVENCIÁK GRAM- BAKTÉRIUMOKBAN I.
Standard szignál peptid
hasítóhely
“N”
1
K vagy R
“H”
“C”
hidrofób  hélix, sok A és L,
nem lehet P, K, R, D, E, H, R
fordulat
P
G
A
V
S
A
G
S
semleges vagy
negatív
COOH
-3
fM
G
fordulat
-1 +1
A
X
Lipoprotein szignál peptid
“N”
1
K vagy R
hasítóhely
“C”
“H”
hidrofób  hélix, sok A és L,
nem lehet P, K, R, D, E, H, R
L
A
G semleges vagy
negatív
COOH
-1 +1
fM
D
lipoprotein kiválasztó
szignál
SZIGNÁL SZEKVENCIÁK II.
Gram-pozítív baktériumok
 a szignál peptid szignifikánsan hosszabb
 kiterjedtebb “H” régió
Eukarióták
 a “H” régióban a Leu dominál
 nem olyan szigorú a (-1, -3) szabály
 a hasítóhely után nincs kitüntetett aminosav
az eukarióta szekretált fehérjéket az E. coli export mechanizmusa
felismer(het)i, illetve fordítva
A Sec függő fehérje transzlokáció modellje
E. coli-ban
INICIÁCIÓ
TRANSZLOKÁCIÓ
KISZABADULÁS
periplazma
SPáz
H+
Y
E
Y
G
A
citoplazma
D
G
A
ATP
ADP+Pi
E
H+
B
citoplazma
Y
A
AT
P
ADP+Pi
C
N
N+
C+
Átjutás a C-terminális
véggel,
ez az áltatános
Átjutás az N-terminális
véggel,
inszerció
E
G
A Sec útvonal - másképpen
A Sec útvonal - másképpen
A prokarióta és eukarióta transzportmechanizmusok
összehasonlítása
Az SRP (Ffh-FtsY) útvonal
membrán fehérjékre jellemző
A Sec és az SRP közötti választás: “trigger” faktor
Signal sequences for targeting
Sec szignál peptid
+
N
n-region
erősen
hidrofób
h-region
c-region
SRP: erősen hidrofób szignál, nem hasad le
Twin-arginine szignál peptid
S/T-R-R-x-F-L-K
n-régió
h-régió
+
N
moderáltan
hidrofób
c-régió
A periplazmitikus hidrogenázok bioszintézise
citoplazmatikus összeszerelődési modell
Holoenzim
Periplazma
csatorna
Citoplazma
szignál peptid
prekurzor
kofaktor(ok)
The twin-arginine translocase (Tat) proteins
periplazma
N
N
N
membrán
C
TatA
C
TatB
TatE
N
TatC
C
citoplazma
C
A TAT modell
membrán
TatB
TatC
TatA
citoplazma
aktív formát felvett enzim