Transcript Document

Szilárd fázisú peptidszintézis
Bánóczi Zoltán
MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport, Budapest
Peptidek és alkalmazásuk
Peptidek aminosavakból felépülő oligomerek.
H2N-CH-COOH
R
H2N-CH-CO- HN-CH-CO- HN-CH-COOH
R
R
n
R
R: sok féle, 20 fehérjealkotó aminosav
Számos alkalmazás
„A” és „Aaa”
jelentése
-HN-CH-CO-
kutatás
gyógyszeripar (Inzulin, Glukagon, Octreotide, Oxicotin)
édesítőszer (aszpartám: Asp-Phe-OMe)
szépségápolás (botox: Clostridium botulinum toxin)
R
Peptidszintézis - kezdetek
Emil Fischer: első peptidszintézis (1903)
BrCH(R)COCl + H2N-CH(R’)CO2H
BrCH(R)CONHCH(R’)CO2H
Carpino: Boc-csoport (1957)
H3C
H2NCH(R)CONHCH(R’)CO2H
O
Bergmann és Zervas: Z-csoport (1932)
H3C
NH3
C
O
O
CH2
O
CH3
Robert Bruce Merrifield:
az első szilárdfázisú peptidszintézis (1963)
Carpino: Fmoc-csoport (1972)
O
O
J. Am. Chem. Soc. 85, 2149
E. Atherton, R.C. Sheppard: Solid phase peptide
synthesis: a practical approach
(IRL Press, Oxford, England, 1989) Fmoc-technika
Peptidszintézis - elv
H2N-CH-COOH
+
H2N-CH-COOH
R
R’
-H2O
Ezt szeretnénk!
H2N-CH-CO- HN-CH-COOH + H2N-CH-CO- HN-CH-COOH + H2N-CH-CO- HN-CH-COOH
R
R
R’
R
R’
R
és még sok minden más!!!
Megoldás
PG-HN-CH-CO-AG + H2N-CH-COOH
R’
R
PG-HN-CH-COOH
R’
-H2O
PG-HN-CH-CO- HN-CH-COOH
PG: védőcsoport
AG: aktiváló csoport
H2N-CH-CO-OPG’
R
-H2O
R
+
PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’
R’
Oldallánc védőcsoportok!!
R
R’
Peptidszintézis - megvalósítás
PG-HN-CH-COOH
R
+
H2N-CH-CO-OPG’
R’
PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’
R
-H2O
R’
Hogyan?
1. Aktivált aminosav-származék
PG-HN-CH-CO-AG
R
ahol AG: -
Cl
N3
OCO-R’
OR’
2. Közvetlen aktiválás
- karbodiimid, DCC, DIC
N
C
CH3
H3C
CH N
N
H3C
C
N
HC
CH3
- in situ aktív észter képzés, DCC-HOBt, BOP-HOBt
Peptidlánc felépítése
1. Stepwise (lépésenkénti) szintézis:
PG-HN-CH-COOH
R
+
H2N-CH-CO-OPG’
PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’
-H2O
R
R’
amino-védőcsoport
eltávolítása
R’
PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’
R”
R
H2N-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’
R
R’
-H2O
védőcsoportok eltávolítása
1 vagy 2 lépésben
R’
+
PG-HN-CH-COOH
R”
H2N-CH-CO-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OH
R”
R
R’
2. Fragmenskondenzáció
Miben más a szilárdfázisú peptid szintézis?
1. A C-terminális karboxil-csoport védelme a gyantával kialakított
kötéssel.
H2N-CH-CO-
A kötés:
- észter
- amid
R
R’
2. Az α-amino-csoport
kötés hasadása nélkül.
PG-HN-CH-CO-
védőcsoportja
R
eltávolítható
PG:
- Boc
a
peptid-gyanta
H3C
H3C
R’
O
O
CH3
- Fmoc
3. Funkciós csoportok védése az
oldalláncokban.
O
O
Gyantatípusok
Gyanta: polisztirol-divinilbenzol kopolimer
CH2
polimerizáció
+
H2C
CH2
Fmoc-technika
Boc-technika
Cl
P
HO
CH2
O
CH2
P
OCH3
Merrifield gyanta
Wang gyanta
CH3
Cl
H3CO
Fmoc
MBHA gyanta
Cl
NH
P
OCH2-CO-Nle-R
H2N
P
Rink amid-MBHA gyanta
Klórtritil gyanta
Első aminosav kapcsolása a gyantához
MBHA és Rink amid-MBHA, akár a többi aminosavat
Merrifield gyanta
Cl
Boc-Aaa(X)-OCs
Boc-HN-CH-CO-O
P
DMF, 50 °C, 48 h
R’(X)
Wang gyanta: Fmoc-Aaa(X)-OH + DIC + DMAP
H2N-CH-CO- O
O
CH2
CH2
P
R’
Klórtritil gyanta: Fmoc-Aaa(X)-OH + DIEA
Cl
H2N-CH-CO-O
R’
P
P
Peptidlánc felépítése
In situ aktivészteres kapcsolás
Boc-technika
N
N
C
N
N
N
DCC
HOBt
OH
Fmoc-technika
CH3
H3C
N
CH N
C
N
N
HC
N
H3C
DIC
CH3
HOBt
OH
Aminosav származék és kapcsolószerek nagy feleslegben (3 ek.≤)
Funkciós csoportok az oldalláncban
Boc-technika
O
Lys
C
O
2-Cl-Z
CH2
Cl
Arg
O
O
S
Tos
CH3
O
Asp, Glu
Cys
O
OBzl
CH2
CH2
CH3
OcHex
O
Meb
O
Ser, Thr, Tyr
C
O
Tyr
CH2
CH2
Br
Bzl
2-Br-Z
O 2N
His
NO2
Dnp
Fmoc-technika
H3C
Lys
H3C
O
O
Boc
O
CH3
CH3
S
O
O
Arg
Asp, Glu
dihidrobenzofurán6-szulfonil)
CH3
OtBu
O
H3C
CH3
Cys
Trt
CH3
Ser, Thr, Tyr
tBu
H3C
CH3
CH3
His
H3C
O
CH3
CH2
Bum
Pbf
CH3 (2,2,4,6,7-pentametil-
H3C
CH3
CH3
Ideiglenes védőcsoport hasítása
Boc-technika
CH3
H3C
O
C
O
HN-CH-CO-
R
R’(X)
CH3
TFA/DCM
CH2
+ CO2 + +H3N-CH-CO-
H3C
R
R’(X)
CH3
Fmoc-technika
O
O
HN-CH-CO-
R
R’(X)
piperidin/DMF
CH2
+ CO2 + H2N-CH-COR’(X)
R
Boc-technika szintézis protokollja
(-) sárga
1)
Gyanta mosása 3-szor DCM-nal; 0,5-1,0 perc
2)
Boc-csoport hasítása 33% TFA/DCM; 2+20 perc
3)
Gyanta mosása 5-ször DCM-nal; 0,5-1,0 perc
4)
Semlegesítés 3-4-szer 5-10% DIEA/DCM; 1 perc
5)
Gyanta mosása 4-szer DCM-nal; 0,5-1,0 perc
6)
Kapcsolás: Boc-aminosav származék-DCC-HOBt DCM-DMF elegyben
(3 ekv. A gyanta kapacitásához képest); 60 perc
8)
Gyanta mosása 2-szer DMF-dal; 0,5-1,0 perc
9)
Gyanta mosása 2-szer DMF-dal; 0,5-1,0 perc
10) Ninhidrin (izatin) teszt
(+) kék
Fmoc-technika szintézis protokollja
(-) sárga
1)
Gyanta mosása 3-szor DMF-dal; 0,5-1,0 perc
2)
Fmoc-csoport hasítása
2% piperidin + 2% DBU/DMF; 2+2+5+10 perc
3)
Gyanta mosása 8-szor DMF-dal; 0,5-1,0 perc
4)
Kapcsolás: Fmoc-aminosav származék-DIC-HOBt DMF-ban
(3 ekv. A gyanta kapacitásához képest); 60 perc
5)
Gyanta mosása 2-szer DMF-dal; 0,5-1,0 perc
6)
Gyanta mosása 2-szer DCM-nal; 0,5-1,0 perc
7)
Ninhidrin (izatin) teszt
(+) kék
Ninhidrin teszt
OH
2
O
OH
O
OH
N
+ NH2-R
O
O
kék
OH
Pro esetén:
O
λ(570nm)
+
N
O-
Nincs különbség a
termék és a ninhidrin
színe között
sárga
O
Teszt oldatok:
Izatin test:
 40 g fenol 10 mL abs. EtOH-ban
 65 mg KCN 100 mL deszt. vízben
(2 mL-t higítunk 98 mL piridin-nel)
 2,5 g ninhidrin 50 mL abs. EtOH-ban
NH
O
3% izatin + 5% Boc-Phe-OH
benzilalkoholban
+ ninhidrin teszt oldatok
A gyanta színe vörös-fekete
Peptid (védőcsoportok) hasítása gyantáról
Boc-technika
Van a peptidben His(Dnp)?
igen
nem
Dnp hasítása
Van N-terminális Boc-csoport?
(tiofenol:DIEA:DMF
3:3:4 (V/V/V))
igen
nem
Boc-csoport
hasítása
A peptid (védőcsoportok)
kompatibilisek HF, TMSOTf, TFMSA?
HF
TFMSA
TMSOTf
Anizole, p-kresol és DTT
10% TFMSA- 10% tioanizol-TFA
1 M TMSOTf-tioanizol/TFA oldat EDT és m-krezol jelenlétében
melyben m-krezol és EDT
CH3
O
H3C
Si
O
S
O
H3C
O
CF3
HO
S
O
CF3
Fmoc-technika
Van N-terminális Fmoc-csoport?
igen
Fmoc hasítás
Van a peptidben Arg, Met, Trp
vagy Trt?
yes
Van a peptidben
Arg, Met?
igen
nem
nem
„A” hasítási elegy
nem
„B” hasítási elegy Van a peptidben Trp
vagy Trt?
igen
nem
B: 0,75 g fenol
0,25 mL EDT
0,50 mL tioanizol
0,50 mL deszt. víz
10 mL TFA
„C” hasítási elegy
A: 0,5 mL deszt. víz
9,5 mL TFA
C: 0,25 mL EDT
0,25 mL deszt. víz
9,50 mL TFA
Peptid tisztítása és jellemzése
Valamennyi izolálás liofilizálással történik. Nyers peptidet
RP-HPLC-val tisztítjuk.
A peptid analitikai jellemzése:
- analitikai RP-HPLC
- tömegspektrométria
Miért jó a kémiai peptidszintézis?
Gén-technológia
népszerű,
viszonylag
olcsó
és
egyszerű,
de
csak
hosszabb
lineáris
fehérjék
felépítésére alkalmas L-aminosavakból.
De nem lehet:
 D-aminosavak
 nem természetes aminosavak
 poszt transzlációs módosítások(Hyp, Pyr, gliko- és
foszfopeptidek)
 nem lehet elágazó láncú vagy
 ciklikus peptid
 fluoreszcens vagy izotóp jelölt peptid
Nem természetes aminosavak
https://www.peptechcorp.com/documents/Unnatural_amino_acids_in_drug_discovery.pdf
Glikopeptidek
T. Buskas et al. Glycobiology, 16, 113R–136R, 2006
Elágazó láncú peptidek
Hordozó peptidek:
H-FRHDSHYX5C-NH2
S-CH2CO-K(S-CH2CO)
H-FRHDSHYX5C-NH2
KRRbA-NH2
H-FRHDSHYX5C-NH2
X=Ø (25, MAP(Ab4-10C)4)
S-CH2CO-K(S-CH2CO)
H-FRHDSHYX5C-NH2
Mező, G., Manea, M. et al. J. Peptide Science 10, 701 (2004)
(Arg)n
fluoreszcein
(Arg)n
Lys
(Arg)n
Lys
(Arg)n
S
Lys
Gly-Cys
n= 1, 2, 4 és 6
Dendrimer szerkezetű sejtpenetráló oligoargininek vázlatos szerkezete
Futaki, S., et al. Biochemistry 41, 7925–7930 (2002)
Ciklikus peptidek
1. Természetes
toxinok
anyagok;
antibiotikumok,
hormonok,
2. Térszerkezet rögzítése
3. Enzimstabilitás növelése
A) Csak amid kötést tartalmaz
- fej-farok
- oldallánc is érintett
B) diszulfid híd, tioéterkötés, észter (lakton), éter,
oxim, tiazolidin … stb.
Fluoreszcensen jelölt peptidek
1. Molekulák
elérhető.
nyomon
követése
–
számos
jelzőmolekula
O
O
COOH
OH
lex = 360 nm
O
lem= 480 nm
HO
HO
O
O
lex.= 490 nm
lem.= 520 nm
O
O
O
HO
5-karboxifluoreszcein
(Flu)
4-(7-hidroxikumaril)-ecetsav
(Hca)
O
NH2
O- Na+
S
NH
O
OH
lex.= 320 nm
lem.= 480 nm
5-[(2-aminoetil)amino]napftalin-1-szulfonsav
(EDANS)
Hca-RQIKIWFQQNRRMKWKKC-NH2
S
S
Ac-CSK(Flu)PIGPDDAIDALSSDFTS-NH2
Hca-RQIKIWFQNRRMKWKKC-NH2
S-CH2CO-SKPIGPDDAIDALSSDFTS-NH2
H-RQIKIWFQQNRRMKWKKSGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH2
A) HcaPenKalpA amid
B) HcaPenKalpC tioéter
C) HcaPenKalpC tioéter
2. FRET (fluorescence resonance energy transfer)
O
H3 C
O
N
N
N
NH
TPLKSPPPSPR
NH
S
NH
H3 C
DABCYL
EDANS
FInt.
DABCYL-TPLKSPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH2
Emésztés előtt
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Emésztés után
cszubsztrát= 200 mM. , cKalpainB= 0,5 µM
lgerj.=320 nm, lem.= 480 nm
350
400
450
500
lgerj.(nm)
550
600
650
O- Na+
O
Hipocampus szöveteket 5 percig kezeltünk a
sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 mM).
Hipocampus szöveteket kezeltünk 5 percig a
sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 mM), majd
kalpasztatin A és C konjugátumot adtunk az
elegyhez (c=5 μM) és a kezelést további 15 percig
folytatuk. Piramidális sejtek régiója (üres nyilak) és
más régiók (tele nyilak).
Házi feladat
Hogyan állítana elő védetlen peptidet a
származékból?
Mi keletkezik a folyamat végén? (Több
lehetséges!)
Fmoc-Ala-Lys(2ClZ)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-O
P
következő
lépés
is