Transcript innen

Kvvn9756/1 A modern kémia problémái
Szintetikus Kémiai Biológia
Riboszómális peptidszintézis
2011. november 9.
Centrális Dogma
•
•
A Centrális Dogma a genetikai
információ áramlását írja le
A sejtmagban a DNS-ből egyszálú
komplementer RNS képződik
(transzkripció)
•
Az RNS a citoplazmába vándorol,
ahol arról a riboszóma fehérjét
készít (transzláció)
•
A fehérje ezután módosulhat
(poszttranszlációs módosulás)
•
A DNS információt tárol
•
Az RNS és fehérjék az
információt továbbítják, az
információátadást katalizálják
Replikáció
DNS polimeráz
Transzkripció
RNS polimeráz
Transzláció
tRNS, riboszóma
DNS és RNS képző nukleotidok
DNS nukleotid mutációk
deamináció
deamináció
deamináció
deamináció
HF*: Miért előnyösebb a természet számára
uracil helyett timint használni a DNS-ben?
DNS és RNS képző nukleotidok
(hipoxantin+ ribóz)
Watson-Crick bázispárok
guanin
citozin
adenin
timin
Watson-Crick bázispárok
guanin
citozin
adenin
timin
Nem Watson-Crick bázispárok
inozin
inozin
citozin
uracil
inozin
guanin
adenin
uracil
Genetikai kód
1.
2.
3.
4.
Három nukleotid kódol egy aminosavat
A kód nem átfedő
A kódban nincsenek „írásjelek”
A genetikai kód degenerált (szinonímák)
Wobble hipotézis
•
az mRNS első két bázisa erős WC párt
alkot a tRNS megfelelő antikodonjával
•
ha az antikodon első bázisa (ami a
kodon harmadik bázisával párosodik) A
vagy C, akkor a bázispárosodás
specifikus, és csak egy kodont ismer fel
a tRNS
•
ha az antikodon első bázisa G vagy U,
akkor kétféle kodont ismer fel a tRNS
(G::C/U; U::A/G)
•
ha az antikodon első bázisa I (inozin),
akkor háromféle kodont ismer fel a
tRNS (I::A/U/C)
•
32 tRNS szükséges a 61 kodon
leolvasásához (31 az aminosavakhoz
és egy az iniciációhoz)
•
A ribszóma ellenőrzi az mRNS kodon
hármasának első két bázisának
illeszkedését
Következmény: Megfelelő specificitsás és sebesség a transzláció során.
Transzfer RNS (tRNS)
•
•
egyszálú RNS, 73-93 bázis
számos módosított bázis (7-15)
– inozin
– metilált származékok
– Pszeudouridin (y)
– ribotimidin (T) stb.
•
•
•
5’ első bázis: guanin (pG)
3’ utolsó bázisok: CCA
3’ végén az adenin 3’ OH csoportja
hordozza az aminosavat
5’
D kar
– aminoacil tRNS
•
•
3’
aminosav
kar
TyC kar
extra kar
antikodon
kar
jellegzetes két- és háromdimenziós
szerkezet
A bázisok közel fele van párosítva
anti kodon
Orvosi Nobel díj 1974
Kémiai Nobel díj 2009
Riboszóma
•
•
•
•
•
Ribonukleoprotein
két alegység: 30S (kis) és 50S (nagy) (2500 kDa)
ribozim: katalitkus tulajdonságú RNS
65% rRNS és 35% fehérje
Oldatban spontán felveszi a szerkezetét
Albert
Claude
Christian
de Duve
George E.
Palade
durvafelszínű
endoplazmatikus retikulum
Memo: Az alegységek méretét Svedberg egységben adják
meg (S), ami a centrifugálás során tapasztalható
szedimentációs tulajdonságára utal. Nem additív.
Venkatraman
Ramakrishnan
Thomas A.
Steitz
Ada E.
Jonath
1. lépés: Aminosav aktiválás
Adeniláció
ATP
aminosav
aminoacil tRNS
szintetáz
20 aminosav
5’-aminoacil adenilát
(aminoacil AMP)
1. lépés: Aminosav aktiválás
Aminoaciláció
•
•
Szükséges, hogy a
helyes aminosav
kötődjön az adott
tRNS-hez
minden aminosavhoz
külön tRNS szintetáz
5’-aminoacil adenilát
(aminoacil AMP)
aminoacil tRNS
szintetáz
tRNS
1. lépés: Aminosav aktiválás
Aminoaciláció
•
•
A riboszóma már nem
ellenőrzi az aminosav
helyességét
a tRNS szintetáznak
kell megkülönböztetnie
az aminosavakat és a
tRNS-eket!
a tRNS
3’ vége
aminoacil
csoport
5’ vég
aminoacil tRNS
szintetáz
aminoacilált tRNS
http://vcell.ndsu.edu/animations/translation/index.htm
5’ UTR
3’ UTR
eukarióta mRNS
metilált 5’ vég
az mRNS stabilitásához
szükséges
3’ UTR: poliadenin
az 5’ UTR régióhoz
kötődik a riboszóma kis
alegysége
az mRNS „olvasható”
része: kodonok
a riboszóma továbbhalad az
mRNS-en egészen az első
kodonig (AUG)
2. lépés: Iniciáció
•
A riboszóma 30S alegysége iniciációs
faktorokhoz, majd az mRNS-hez kötődik
•
Az IF faktorok meggátolják, hogy az 50S
alegységgel komplexet alkosson
•
Az 5’ UTR régió speciális szekvenciája
irányítja a riboszómát az AUG
szekvenciához
•
GTP adja az energiaforrást
•
A fehérjeszintézis mindig a fehérje Nterminálisával kezdődik, és a karboxiterminálison növekszik a peptidlánc
•
Az első aminosav egy metionin vagy
formilmetionin (baktériumoknál,
mitokondiumban stb.), amit külön Met-tRNS
hordoz
30S alegység
aminoacil tRNS
AUG  metionin
anti kodon
miután bekötött az első tRNS,
a riboszóma nagy alegysége is
rákapcsolódik az mRNS-re
kodon és antikodon
egymással
komplementerek
a riboszómának két fontos
aktív helye van: Peptidil (bal)
és az Aminoacil (jobb)
az első tRNS a P a második
az A helyet foglalja el
az A tRNS-sének
aminosavja (NH2 csoport) SN
reakcióval átveszi a P tRNS
aminosavját
3. lépés: Elongáció
23S rRNS
a)
b)
c)
következő tRNS kötődése (GTP)
peptid kötés kialakítása (ribozim katalizálta reakció)
transzlokáció (GTP)
3. lépés: Elongáció
az első tRNS a P a második
az A helyet foglalja el
a riboszóma tovább halad, az
eddigi A helyen levő tRNS
most a P helyre kerül
az A tRNS-sének
aminosavja (NH2 csoport) SN
reakcióval átveszi a P tRNS
aminosavját
új tRNS érkezik, új peptid
kötés alakul ki
a P helyről távozik a tRNS
mindig a kodonnak megfelelő
tRNS érkezik, és a megfelelő
aminosavval bővül a peptidlánc
a peptidlánc növekszik
a riboszóma addig halad
tovább, amíg egy stop
kodonhoz nem ér
a riboszóma nem képes
továbblépni
a peptid leválik az utolsó
tRNS-ről, és elhagyja a
riboszómát
ekkor nem egy tRNS, hanem
egy leoldó (releasing) faktor
köt az A helyre
a riboszóma alegységeire
esik szét
4. lépés: Termináció
•
•
•
UAA, UAG vagy UGA kodonoknál megáll a fehérjeszintézis
RF1 az UAA vagy az UAG, RF2 az UAA vagy UGA kodonok helyére köt
RF tRNS-re hasonlító fehérje
HF: Milyen aminosav szekvenciát kódol az alábbi
mRNS szakasz? Mi lenne a következménye az A  G
mutációnak a nyíllal jelölt helyen?
mRNS
5’ AACUGCACGAGGUAACACAAGAUGGCU 3’
A
Kvvn9756/1 A modern kémia problémái
Szintetikus Kémiai Biológia
Nem-természetes aminosavat
tartalmazó fehérjék bakteriális
expressziója
2011. november 9.
Miért van szükség módosított fehérjékre?
•
A természetes fehérjék is átesnek
poszttranszlációs módosuláson:
–
–
–
–
•
Glikolizáció
Foszforiláció
Metiláció, hidroxiláció
Diszulfid híd
A prokariótában expresszált
fehérjéket in vivo bonyolult
poszttranszlációsan módosítani
Hogyan építhetünk be nem-természetes
aminosavat a fehérjébe?
•
•
•
Totál szintézissel
Expresszált fehérje ligációval
Kiterjesztett genetikai kóddal
•
Biokémiai kérdések
megválaszolása kedvéért
– Szerkezeti információ
– Stabilitás
– Reaktivitás
•
Spektroszkópiai próbák
–
FRET: fluoreszcens próba
Izoszterikus aminosav beépítése
ATP
metionin
tRNS
szintetáz
•
•
Az aminoacil tRNS szintetáz becsapható hasonló méretű és alakú aminosavval
Olyan E. coli törzs kell hozzá, amelyik nem tud metionint szintetizálni (metionin
auxotróp)
•
Ha az E. coli-t olyan táptalajban növesztjük, amihez metionint adtunk, akkor ezt a
metionint beépíti a szervezetébe
Izoszterikus aminosav beépítése
ATP
metionin
tRNS
szintetáz
•
•
Az aminoacil tRNS szintetáz becsapható hasonló méretű és alakú aminosavval
Olyan E. coli törzs kell hozzá, amelyik nem tud metionint szintetizálni (metionin
auxotróp)
•
Ha az E. coli-t olyan táptalajban növesztjük, amihez azidohomoalanint adtunk,
akkor ezt az aminosavat beépíti a szervezetébe a metioninok helyére
Hátrányok: Mindig egy meglevő aminosav helyére lehet az új aminosavat beépíteni, így
nincs 21-dik aminosav. Csak kevés aminosavval működik. Több helyre is beépül az új
aminosav.
Hogyan lehet egy 21-dik aminosavat beépíteni a
fehérjébe?
Megoldás
Feltételek
– egyedi kodon a 21-dik aminosav
számára
– komplementer aminoacil tRNS
mRNS
stop kodon
– STOP kodon
– aminoacil tRNS mesterséges
szintézise
• 74-mer szintézise biológiailag
DNS templáttal (más
organizmusból)
• aminoacil-dinukleotid
szintézise kémiailag
• RNS ligázzal összekapcsolni
Hogyan lehet egy 21-dik aminosavat beépíteni a
fehérjébe?
Stratégia
– Módosítsuk a fehérjét kódoló DNS kodonját a mesterséges aminosav helyén egy
STOP kodonra (TAG)
– Az E. coli sejteket falait bontsuk fel úgy, hogy egy „in vitro” expressziós rendszert
kapjunk
• Ekkor a transzkripció és a transzláció is a kémcsőben történik
– Adjuk a rendszerhez a mesterséges tRNS-t
– A riboszóma folytatni fogja a fehérjeszintézist, és nem áll meg az UAG stop
kodonnál
Ritka DNS kódolt aminosavak
• Néhány anaerob archaea és
egy ismert baktérium kódol
pirrolizint.
UGA
stopkodon
kódolja
UAG
stopkodon
kódolja
• Metán metabolizmus
enzimének aktív helyén
található.
• Van saját pirrolizil-tRNS
szintetáz enzime, ami a
pirrolizilt szállító tRNS-hez
köti.
Monometilamin metiltranszferáz
(PDB: 1L2Q)