Transcript RG_Biotech

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN
HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete
A Haemophilus influenzae restrikciós endunuklázának felfedezése
Három fő csoport
I típus
Specifikus szekvenicákat ismer fel, de elvándorol a DNS-en
(~1000-5000 bázis) mielőtt az egyik szálat elhasítja,
nukleotideokat szabadít fel (~75) a hasítás helyén.
Egy másik endonuckleáz kell a második szál hasításához
Pl. EcoK.
Mg2+, ATP és SAM (S-adenosyl methionine) SAM kell hozzá
1
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN
HASZNÁLATOS ENZIMEK
II típus
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
Speciális célszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon
a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében
pl. EcoRI
Mg2+ kell
Ez a típus az elterjedt
III. típus
I és II. Kombinációja. Mindkét DNS szálat hasítja
egy meghatározott távolságra a felismerési szekvenciától
plHgaI
Mg2+-t ésATP-t igényel
2
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN
HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
Enzim
AluI
Felismerőhely Felismerő-hasítóhely Forrás organizmus
hossza
4
AG/CT
Arthrobacter luteus
HphI
5
GGTGAN8/
Haemophilus parahaemolyticus
EcoRI
6
G/AATTC
Escherichia coli
BamHI
6
G/GATCC
Bacillus amyloliquefaciens
Ragadós végeket adó hasítások (sticky end)
5' túlnyúló
SalI
6
5' G TCGAC 3'
3' CAGCT G 3'
Streptomyces albis
6
5' GGTAC C 3'
3' C CATGG 5'
Klebsiela pneumonia
3' túlnyúló
KpnI
Tompa végű hasítások (blunt end)
HaeIII
4
5' GG CC 3'
3' CC GG 5'
Haemophilus aegyptus
3
Palindrom példák
KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA
RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT
NEM KERESIK
4
Isoschisomers
AtcI
KpnI
6
5' GGTAC/C 3'
5' GGTAC/C 3'
XmaI
SmaI
6
5' C/CCGGG 3'
5' CCC/GGG 3'
Kompatibilis véget adó enzimek
SalI
XhoI
6
5' G/TCGAC 3'
5' C/TCGAG 3'
FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL
KITÜNTETT ENZIMEK
AflIII
6
5' A/CPuPyGT 3'
BspHI
6
5' T/CATGA 3'
NcoI
6
5' C/CATGG 3'
NdeI
6
5' CA/TATG 3'
5
DNS METILÁZOK
- dam metiláz (dezoxiadenin metiláz)
5’ GATC 3’ felismerő hely N6 pozícióban metilez
N
N
N
N
N
adenin
sok dam metiláz érzékeny enzim van pl. MboI, XhoI,
egyenként ellenőrizni kell,
érzékenység esetén
- dam- törzs használata
- nem érzékeny izoskizomer használata (ha van) (MboI - Sau3AI)
6
-dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz)
5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C5 pozícióban metilez
N
- hasonlóképpen léteznek dcm metiláz érzékeny
enzimek
- megoldás ugyanaz, mint a dam esetén
N
N
O
citozin
Sok metiláz van még,
hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek
pl. M. EcoRI metiláz
7
Polimerázok
- DNS függő DNS polimerázok
- RNS függő DNS polimerázok
- Templátfüggetlen DNS polimeráz
- DNS függő RNS polimeráz
5’  3’ polimeráz aktivitás
8
DNS függő DNS polimerázok
9
10
DNS jelölés, nick transzláció
11
12
Templát független DNS polimeráz
13
RNS függő DNS polimeráz
14
A ligáz csak
5’ foszfát – 3’ OH végeket tud
összekapcsolni,
ha a vektort defoszforiláljuk, nem
tud önligálódni
15
DNS ELVÁLASZTÁSA
ELEKTROFORÉZIS
denaturáló
nem-denaturáló
lúgos, (DNS, agaróz)
formaldehid, glioxál, DMSO
(RNS, agaróz)
Nincs roncsoló ágens
urea (DNS, akrilamid)
méret
> 50 kb
100bp-50 kb
< 1000 bp
Mátrix
technika
agaróz
pulzáló gélelektroforézis
agaróz 0.5- 2%
hagyományos gélelektroforézis
poliakrilamid
(5-20%) hagyományos
LÁTHATÓVÁ TÉTEL:
etídium bromid, interkaláló festék nem-denturáló körülmények,
elsőősorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is.
A DNS 254 nm-en elnyel energia a festékre  590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel el
Lehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni.
Érzékenység kb 10 ng
Egyéb festékek,
fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülményközött
.
radioaktivitás: minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta sugárzók
16
Horizontális gélelektroforézis
17
DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL
- közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t
- a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével
AGARÓZ
- dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízis
a kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholos
kicsapással, univerzális, széles mérettartomány
- fagyasztásos
módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80oC-on
megfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik,
ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető
további tisztítás szükséges, univerzális
- kromatográfiás módszerek
6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad) szilikagél felületére kötődik,
a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható,
majdnem univerzális, elég széles mérettartomány
DEAE membránba futtatjuk a DNS-t,
innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálható
nagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb esetén
jó a kitermelés
POLIAKRILAMID (PAGE)
a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljuk
majd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk
18
Klónozás fogalma
Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségével
gazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunk
Szubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása
vektor
Hasítás, A,B enzimekkel
Hasítás, A,B enzimekkel
A
inszert
A
B
B
ligálás
Transzformálás,
felszaporítás,
tisztítás
Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni,
19
Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.
Bacterium
Cell containing gene
of interest
Plasmid
Bacterial
chromosome
Gene of
interest
DNA of
chromosome
Recombinant
DNA (plasmid)
Recombinate
bacterium
Gene of
interest
Copies of gene
3
Protein expressed
by gene of interest
Protein harvested
Basic
research
on protein
Basic
research
on gene
Figure 20.2
Gene for pest
resistance inserted
into plants
Gene used to alter
bacteria for cleaning
up toxic waste
Protein dissolves
blood clots in heart
attack therapy
Human growth
hormone treats
stunted growth
20
KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT
VEKTORTÍPUSOK
példa
plazmidok
fonalas fágok
fagemidek
l fágok
kozmidok
BAC, YAC
pUC18,19
mp18, 19
pBluescriptKS, SK±
EMBL3,4
pHC79
pBAC108L, pYAC3
inszert méret
< 10 - 15 kb
< 5 - 10 kb
< 10 - 15 kb
néhányszor 10 kb
néhányszor 10 kb
néhány 100 kb
BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome
PLAZMIDOK
rezisztencia marker
replikációs origo
ORI
Cirkuláris kettősszálú
extrakromoszómális elemek
21
NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM
koncentráció
(µg/ml)
antibiotikum
működési mód
a rezisztencia módja
ampicillin
bakteriocid, sejt fal
szintézis inhibitor
a  laktamáz elhidrolizálja az
ampicillin  laktám gyűrűjét
50 -100
klóramfenikol
bakteriosztikus, fehérje
szintézis inhibitor,
kölcsönhat az 50S
riboszoma alegységgel
klóramfenikol acetiltranszferáz (cat)
acetilálja a klóramfenikolt
20
kanamicin
bakteriocid, fehérje
szintézis inhibitor
aminoglikozid foszfotranszferáz
illetve nukleotidtranszferáz
foszforilálja vangy adenilálja a
kanamicint
30 - 500
tetraciklin
bakteriosztatikus,
proteinszintézis inhibitor,
gátolja az aminoacil-tRNS
kötődését a riboszómához
a sejt permeabilitásának
csökkentésével a tetraciklin nem tud
bejutni a sejtbe
15
22
Egy ősi plazmid: pBR322
23
Magas kópiaszámú változat: pUC19
24
Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása
-antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik,
ha inszert épül be,
fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges
- kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható
- plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel
hosszú fáradtságos
- polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus
gyors ha nincs más szelekció
- kék fehér színszelekció,
- pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron,
az inszert beépül, elrontja a gént  megszűnik a letalitás
- auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás
ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén
25
Kolónia hibridizáció
26
LacZ a komplementáció
F' plazmidon: defektív - galaktozidáz gén, hiányzik 11- 41. aminosav
közötti régió
bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiót
és az 1-146 aminosavat
a kettő együtt: aktív  – galaktozidáz
 X-gal szubsztráttal kék telep
a bevitt N-terminális fragmentben :
polilinker régió (leolvasási keret marad)
ebbe lehet klónozni fragmentumot,
ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el
 X-gal szubsztráttal kék telep,
ha elromlik vagy nagy fragment  X-gal szubsztráttal fehér telep
27
PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI
1. Kémiai transzformálás
Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejt
A sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat
(Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük,
sejtfal permeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá
:
transzformációs hatékonyság:
transzformáns /µg DNS
elvi szám a transzformációt  1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre
normál érték: 106 – 108
nagyon jó: 109
a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők:
-oldatok edények tisztasága,
- sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete
- hősokk hőmérséklete hossza
- permeabilizáló faktor
a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé
egyéb fogások:
-spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezt transzformáljuk
- a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt
28
Elektroporáció
A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines
(nagy ellenállású  600 ) pufferben szuszpendáljuk
nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-ig
transzformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (1010/µg DNS)
sejttípusonként optimalizálni kell
maghatározó faktorok:
- az oldat ellenállása
- az impulzus nagysága, hossza
- permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása
29
A l fágok általános felépítése
 genetikai anyag: 40-50 kb duplaszálú lineáris DNS
 fertőzéssel jut a sejtbe,  nagy hatékonyság
 két életciklus:
- lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél
- lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak
 a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek
bal kar 20 kb
EcoRI
BamHI
SalI
centrális régió 14 kb
jobb kar 9 kb
cos
cos
EcoRI
BamHI
SalI
a középső, centrális régió
eltávolítható
30
31
Speciális λ fág fajták
32
Mesterséges kromoszómák:
BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok
33
Mesterséges kromoszómák:
YAC (yeast artificial chromosome) vektorok
34
KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI
- genomiális
- cDNS
a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz
(pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok)
mind prokariótákból, mind eukariótákból
az aktívan termelődő mRNS-ekből készül
csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza
(nincs intron szabályozó régió stb)
csak eukariótákból
expressziós
a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk,
ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet
Követelmények a könyvtárakkal szemben
- fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt
- ne legyen redundáns
35
GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA
hasító helyek
bal kar
centrális régió
bal kar
jobb kar
emésztés
jobb kar
részleges vagy
teljes emésztés
20-24 kb méretű
fragmentek
ligálás
konkatamer
in vitro pakolás: összekeverés l fágfehérje extraktummal
A pakolódás feltétele, hogy a
rekombináns gemon mérete a
vad típus méretének
79 – 105 %- a lehet.
36
cDNS könyvtár
A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények
 Integritás
 A mRNS mérete, degradált-e
Megoldás: denaturáló gélelektroforézis
(várt méret 0.5 - 8 kb, a többség 1.5 -2 kb)
 Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni
Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal
elektroforézis
 Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni
Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal
 A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni
Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció
37
cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel
38
RENDELKEZÉSRE ÁLLÓ VAGY SZÜKSÉGES INFORMÁCIÓK
A KERESETT FEHÉRJÉRŐL, ILLETVE GÉNJÉRŐL
- nem tudunk semmit
- ismeretek a fehérje funkciójáról
csak fenotípus alapján jellemezhető
van tisztított fehérje
mutagenezis (transzpozon)
kromoszomális séta
fehérje funkció tesztelhető
expressziós könyvtárak
már van ilyen fehérje illetve gén más típusú
sejtekből
fehérje szekvenálás
heterológ próba használata könyvtárak
átvizsgálásához
ellenanyag termeltetés
DNS próba tervezés
expressziós könyvtárak
EGYÉB
pl. ha a fehérje szabályozása ismert  szubsztraktív hibridizáció
- számítógép, adatbankok
genom szekvenálások
39
A POZITÍV KLÓNOK TOVÁBBI FELDOLGOZÁSA
A könyvtárakból kapott klónok általában túl nagyok közvetlen
felhasználáshoz, ezért további munkálatok szükségesek:
1. AZ INSZERT RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉSE
2. A TÉRKÉP ALAPJÁN AZ INSZERT KISEBB DARABOKBAN
TÖRTÉNŐ SZUBKLÓNOZÁSA
3. AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA
4. AZ INSZERT SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA
5. SZÁMÍTÓGÉPES ADATFELDOLGOZÁS
A SZEKVENCIÁN BELÜLI GÉNEK, ELEMEK AZONOSÍTÁSA
40
RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉS
41
Klónozás, szubklónozás
A
vektor
Hasítás, A,B enzimekkel
A
B
C
Hasítás, A,B enzimekkel
A
inszert
A
B
B
ligálás
Transzformálás,
felszaporítás,
tisztítás
42
AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK
MEGÁLLAPÍTÁSA
43
FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK
PROKARIÓTÁK
E. coli
ismert,
Bármilyen fehérje, feltéve, ha
- nem túl nagy
- nem túl kicsi
- nem túl hidrofób
- nincs túl sok cisztein benne
szekréciós rendszere minimális
Bacillus subtilis
jól ismert, ha nem is annyira,
mint az E. coli
van szekréciós rendszere
EUKARIÓTÁK
élesztő
gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal,
sok ismeretanyag
viszonylag könnyű kezelhetőség
poszttranszlációs modifikációk lehetősége
emlős sejtvonalak
 minden fajta fehérje termeltethető
bennük
 tranziens expressziós rendszerek
viszonylag gyors, de korlátozott
lehetôségek,
 stabil expressziós rendszerek
 hosszú, fáradságos optimalizálást 44
igényel
PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS
VEKTOR ELEMEI
SZF
GS
TSZE
Pr
-35 -10
SD
kódoló szekvencia
STOP
kodon
UAAU
UGA
UAG
-10
-35
TTGACAN17TATAAT
5’ UAAGGAGGN(3-11)
AR
Pr: promóter
TT: transzkripciós terminációs szignál,
SZF: szabályozó fehérje,,
TSZE: transzlációt szabályozó elemek,
SD: Shine-Dalgarno szekvencia,
TT
START kodon
AUG
GUG
UUG
ORI
AR: antibiotikum rezisztencia,
ORI: replikációs origo
GS: gazdasejt
45
cDNS-ből készült expressziós könyvtárból
- Immunológiai detektálás poli- vagy monoklonális ellenanyaggal
- Aktivitás mérés (csak bizonyos szerencsés esetekben)
- Valamilyen módon jelölt liganddal (ha van a keresett fehérjének) 46
Polimeráz láncreakció I.
Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb.
Soknak nincs 3’  5’ exonukleáz aktivitása  “A” túlnyúló
47
Polimeráz láncreakció II.
48
A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I.
- FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA
minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav,
ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket 
speciálisan tervezett primerek segítségével PCR
a termék megjelenése fertőzésre utal
49
Pontmutációk kimutatása RFLP-vel.
Rerstrikciós fragment length polimorfizmus
Normal  -globin allele
201 bp
175 bp
DdeI
DdeI
Large fragment
DdeI
DdeI
Sickle-cell mutant -globin allele
Large fragment
376 bp
DdeI
DdeI
DdeI
(a) DdeI restriction sites in normal and sickle-cell alleles of
-globin gene.
Normal
allele
Sickle-cell
allele
Large
fragment
376 bp
201 bp
175 bp
Figure 20.9a, b
(b) Electrophoresis of restriction fragments from normal and
sickle-cell alleles.
50
A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II.
MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA
normális
A
C
mutáns
5'
3'
gén
5
'
5
'
A 3'
A
3'
C
PCR
nincs termék
egészséges
5
'
beteg
5
'
C 3'
A
3'
C
PCR
nincs termék
beteg
egészséges
51
Centrális dogma és a bioinformatika főbb
területei a molekuláris biológiában
Gén
DNS
transzkripció, RNS szerkesztés
transzkriptomika
RNS
degradáció
transzláció, poszttranszlációs
módosítás
fehérje
proteomika
degradáció
biokémiai aktivitás
metabolikus útvonalak
metabolomika
52
Genom szekvenálási stratégiák
Shotgun
Primerséta
53
Alternatív shotgun stratégiák
térképezés:
-genetikai:gének,tulajdonságok pozícionálása
-fizikai:szekvenciák,gének rendeződése
54
Genom térképezés fajtái
Cytogenetic map
Chromosome banding
pattern and location of
specific genes by
fluorescence in situ
hybridization (FISH)
Chromosome
bands
Genes located
by FISH
1
Genetic (linkage)
mapping
Ordering of genetic
markers such as RFLPs,
simple sequence DNA,
and other polymorphisms
(about 200 per chromosome)
Genetic
markers
2
Physical mapping
Ordering of large overlapping fragments
cloned in YAC and BAC
vectors, followed by
ordering of smaller
fragments cloned in
phage and plasmid
vectors
Overlapping
fragments
3
DNA sequencing
Determination of
nucleotide sequence of
each small fragment and
assembly of the partial
sequences into the complete genome sequence
…GACTTCATCGGTATCGAACT…
Figure 20.11
55
A gének eloszlása nem egyenletes
Staining techniques used to produce chromosome banding patterns
Technique
Procedure
Banding pattern
G-banding
Mild proteolysis followed by staining with Giemsa
Dark bands are AT-rich
Pale bands are GC-rich
R-banding
Heat denaturation followed by staining with Giemsa
Dark bands are GC-rich
Pale bands are AT-rich
Q-banding
Stain with quinacrine
Dark bands are AT-rich
Pale bands are GC-rich
C-banding
Denature with barium hydroxide and
then stain with Giemsa
Dark bands contain constitutive
heterochromatin
56
Southern blot és hibridizáció
57
Restrikciósfingerprint
RepetívDNSfingerprint
KlónozottDNS
fragmentumok
EST: expressed sequence tag
STS: sequence tagged site
egyedi 100-500 bp fragment
58
Bakteriális shot-gun könyvtár készítése
E. coli
transzformálás
kromoszómális DNS
elektroporálás
nebulizátor
2-3,5 kb
fragmentek
végek
tompítása
összetört DNS
defoszforilálás
Preparatív gél elektroforézis
59
A szekvenciák feldolgozása
szekvenciaanalízis
ellenőrzés,
validáció
Phrap
SeqMan/DNASTAR
STADEN
programcsomag
Vektor és egyéb szennyező
szekvenciák eltávolítása
Gyenge minőségű
szekvenciák eltávolítása
Vector_clipping
Phrap
Átfedő fragmentumokból kontigok összerakása
Phred
60
De ha sikerül, és van szekvenciánk
Mi van rajta,van-e gén? Honnan tudjuk, hogy
Valamit találtunk, találtunk-e gént?
CTCGAGACGCTGTTTCTGGGGTCATTCATTCTTGGCGGGCTGCAACTGCTGGTGTGACCGACGCGACCTGGCAGGCCGCGGTGCGCAACTGGCCGGGCGGACTAATGGTGGAGCAAAAGA
TCGGCATGTCCAGCGCACCTGAAGCTTGGGTGGTTGCTGCAATAGCAGCCTTCCTTATTGGCATGGCGAAGGGCGGTTTGGCCAATGTGGGGGTTATCGCCGTTCCCTTGATGTCCCTGG
TCAAGCCGCCGCTTACCGCTGCCGGATTGCTGCTCCCGATCTATGTCGTTTCTGATGCATTCGGCGTCTGGCTTTATCGGCACCGGTATTCTGCCTCCAATCTGCGCATCCTGATTCCTT
CGGGATTTTTTGGGGTCCTGATTGGCTGGTTATTGGCCGGGCAGATCTCCGACGCGATTGCCAGTGTCATTGTTGGTTTCACCGGCTGCGGCTTCGTGGCTGTGCTGCTGGCACGACGAG
GGGTGCCATCGGTGCCGCGTCAAGCCAACGTGCCCAAAGGATGGTTTCTGGGGGTGGCCACCGGCTTTACCAGCTTTTTGACTCATTCCGGTGCGGCGACCTTCCAGATGTTCGTGCTGC
CGCAACGGCTGGACAAGACCATGTTCGCGGGCACATCAACGCTTACCTTTGCTGCCATAAACCTATTCAAGATTCCGTCCTACTGGGCATTGGGACAGCTTTCGACTTCCTCGGTCATGT
CCGCGCTAGTGTTGATTCCGGTGGCCGTGGCCGGGACGTTCGCAGGTGTTTTTGCGACGCGCAGGCTATCGACATCCTGGTTCTTCATTCTGGTCCAGGCGATGTTGCTGGTGGTCTCCA
TTCAGCTTCTGTGGAGGGGAATGTCGGATATCCTGAACTAGCTGGAGATCGCAATGTCAGAACGCTCAATCAATCAGAATGTAATCTTGACATAGAATACCGTTCCGATTTATTGCTTCG
AGTGAAGCTGCCCGTCCGCTGAGATGTCATGACATTTTCCCCGCTTGATTCCGCCCTGCTTGGACCGTTGTTCGCGACCGATGAAATGCGCACGGTCTTCTCCGAACGGCGTTTTTTGGC
GGGAATGCTTCGTGTTGAAGTGGCCCTGGCGCGCGCGCAGGCGGCAGAGGGCCTTGTCAGTTCGGAATTGGCCGACGCGATCGAGGTTGTTGGTACTGCCGGGTTGGACCCCGAGGCGAT
GGCGGCGACTACTCGCATGACAGGAGTGCCCGCAATATCGTTCGTCCGTGCGGTGCAATCGGCCCTGCCGCCCTCACTGGCGGGTGGATTTCATTTCGGCGCCACCAGTCAAGACATCGT
GGATACGGCCCACGCGCTCCAGCTGGCCGAGGCACTCGATATTATAGAAGTCGATTTACACGCCACTGTCAGCGCAATGATGAATCTGGCCGCTGCTCACTGCAATACACCCTGTATCGG
GCGCACGGCCTTGCAGCACGCAGCGCCAGTTACGTTCGGCTACAAGGCGTCCGGCTGGTGCGTTGCCCTGGCGGAGCATCTGGTGCAGCTTCCCGCGCTGCGAAAGCGGGTTCTGGTGGC
GTCGCTAGGGGGGCCGGTTGGTACCCTTGCCGCGATGGAGGAGCGGGCCGACGCTGTACTGGAGGGTTTCGCTGCGGACCTGGGGTTGGCCATTCCCGCCCTGGCCTGGCACACGCAGCG
GGCCCGGATCGTCGAGGTGGCCAGTTGGCTGGCCATATTGCTGGGAATTCTGGCAAAAATGGCCACCGATGTCGTTCACTTGTCCTCCACGGAAGTGCGCGAGCTTTCCGAACCTGTAGC
GCCGGGCAGGGGGGGCTCCTCGGCGATGCCTCACAAGCGGAACCCGATTTCCTCGATTACCATCCTGTCCCAGCATGCTGCGGCAGGGGCCCAGCTCTCCATTCTCGTGAACGGCATGGC
CAGTCTGCACGAACGTCCGGTGGGGGCGTGGCATTCGGAATGGTTGGCTCTGCCGACGCTGTTCGGCCTTGCCGGCGGTGCCGTGCGCGAGGGCAGGTTTCTGGCCGAGGGGCTGCTGGT
CGATGCCGACCAGATGGGTCGCAATCTACAATTGACCAATGGCCTGATTTTCAGCGACGCGGTAGCCGGCCAGTTGGCAAAGCACTTGGGTCGGGCCGAGGCTTATGCCGCTGTCGAGGA
TGCCGCCGCCGAGGTGTTGCGTTCAGGCGGCAGCTTTCAGGGTCAGCTGAACCAGCGCCTGCCCGATCACCGCGACGCTATCGCTATTGCTTTTGATACGACGCCGGCGATCCAGGCCGG
GGCCGCCCGCTGCCGTAGTGCGCTGGATCATGTGGCTCGTATTCTTGGACCCGCCTCTACCATCGGATTTCAAGGAGGCTAATGACGTGACGACACTGTTTGAGGCGACGACCATCCCGA
TTTGCGAGGGCCCGCGCGACCAGACCGCCGAGATCCTTTTCGAGATGCCGCCGGGTGCGTGGGATACCCATTTTCATGTTTTTGGCCCAGTTTCATCGTTTCCATACGCAGAACACAGGC
TCTATTCCCCACCGGAGTCGCCACTTGAGGATTATCTGGTGTTGATGGAGGCTTTGGGGATCGAGCGCGGCGTTTGTGTCCATCCGAATGTTCATGGTGCCGACAATTCGGTGACGCTCG
ACGCAGTTGCGCGGTCCGATGGTCGTCTGCTGGCGGTGATCAAGCCACATCACGAGATGACTTTTGTTCAGCTGCGGGACATGAAGGCGCAGGGGGTCTGCGGGGTACGTTTTGCCTTCA
61
ATCCGCAGCATGGCTCGGGCGAGTTGGATACTCGTTTGTTCGAGCGTATGTTGGACTGGTGCCGCGACCTAGGCTGGTGCGTAAAATTGCATTTCGCGCCCGCTGCGCTGGACGGTCTGG
CTGAACGTTTGGCGCGCGTCGATATTCCGATCATCATCGATCATTTCGGGCGGGTGGACACCGCGCAAGGTGTGGATCAGCCGCACTTCCTGCGTTTGCTCGATCTGGCCAAACTGGACC
Fehérjeszekvenciák összehasonlítása
62
Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis
Ar1
oriV
oriT
oriV: szűk gazdaspecificitás
Ar2
Ar: antibiotikum rezisztencia
Ar2
oriT
oriV
Ar1
Ar2
vad típus
mutáns
poláris hatás 63
Génsűrűség különböző élőlényekben
Table 20.1
64
Radioaktív génspecifikus próba
Dot-blot technika
Különböző sejtekből preparált
teljes RNS-ek szilárd hordozóra
kötve
A pozitív RNS minták
jelölődnek
Hibridizáció
Teljes RNS jelölése
Reverz dot-blot technika
Génspecifikus minták
rögzítése szilárd hordozóhoz
Hibridizáció
DNS-chip technika
DNA-chip Lab.BRC, Szeged
Pozitív génspecifikus
minták jelölődnek
Hibridizálás
100-20,000
Génspecifikus
minta
65
Alkalmazások, humán génterápia
Cloned gene
(normal
allele,
absent
from
patient’s
cells)
Viral RNA
2
Retrovirus
capsid
Bone
marrow
cell from
patient
Figure 20.16
66
Alkalmazások, transzgenikus állatok
Figure 20.18
67
Alkalmazások, transzgenikus növények
APPLICATION
Genes conferring useful traits, such as pest resistance, herbicide resistance,
delayed ripening, and increased nutritional value, can be transferred from one
plant variety or species to another using the Ti plasmid as a vector.
TECHNIQUE
1
Figure 20.19
The Ti plasmid is isolated from the bacterium Agrobacterium
tumefaciens. The segment of the plasmid that integrates into
the genome of host cells is called T DNA.
2
Isolated plasmids and foreign DNA containing a gene of
interest are incubated with a restriction enzyme that cuts in
the middle of T DNA. After base pairing occurs between
the sticky ends of the plasmids and foreign DNA
fragments, DNA ligase is added. Some of the resulting
stable recombinant plasmids contain the gene of interest.
3
Recombinant plasmids can be introduced into cultured plant
cells by electroporation. Or plasmids can be returned to
Agrobacterium, which is then applied as a liquid suspension
to the leaves of susceptible plants, infecting them. Once a
plasmid is taken into a plant cell, its T DNA integrates into
the cell‘s chromosomal DNA.
RESULTS
Transformed cells carrying the transgene of interest can regenerate
complete plants that exhibit the new trait conferred by the transgene.
Agrobacterium tumefaciens
Ti
plasmid
Site where
restriction
enzyme cuts
DNA with
the gene
of interest
T DNA
Recombinant
Ti plasmid
Plant with
new trait
68
Alkalmazások, kriminológia, apaság, anyaságvizsgálat
Defendant’s
blood (D)
Blood from
defendant’s
clothes
4 g
D
Jeans
Victim’s
blood (V)
8 g
shirt
V
69
Alkalmazások, környezetvédelem
Olaj,
Klórozott szénhidrogének,
Bármilyen ártalmas anyag
16 h
84 h
70
Szulfonált aromás vegyületek lebontása
Nitrokémia Rt.
elfolyó szennyvízben nagy mennyiségű szulfanilsav
azofestékek, növényvédőszerek, antibiotikumok alapanyaga
Igény biológiai eltávolításra
szulfanilsav
NH2
p-aminobenzoesav
NH2
HO S O
O
HO
O
folsav
HO
O
N
N
H2N
N
• ezzel a tulajdonságával
egyedülálló a világon
O
N
OH
NH
• Izoláltunk egy baktériumot,
mely képes a szulfanilsavat,
mint egyedüli szén-, nitrogénés kénforrást hasznosítani
OH
O
N
71
A SZULFOKATEKOL DIOXIGENÁZT KÓDOLÓ
GÉNEK KROMOSZÓMÁLIS RÉGIÓJA
gene
orf1
length
(aa)
function
259
hypothetical conserved protein
homology
(%)
NH2
NADH+H
+ NAD+
SO -3
pcaB
~ 450
3-carboxy-cis-cis muconate
cycloisomerase
40-45
orf2
319
putative hydrolase
40
mac
A
orf3
359
maleil acetate reductase
45-55
395
szulfanilát
O
2
OH
OH
SO-3
4-szulfokatekolát
P340 II 3,4 dioxigenáz
COOCOO
SO 3szulfomukonát
?
putative oxidase
3-karboximukonat
cikloizomeráz
COO O
pca
H
pcaG
245
istB
proto(sulfo)catechol-3,4
dioxygenase beta subunit
80, 67, < 60
195
proto(sulfo)catechol-3,4
dioxygenase alfa subunit
64, 61,
19
IS21 transposase, C-terminal end
100
pcaB
orf2
macA
szulfolakton
szulfolakton hidroláz
pSC1/48 (7404 bp)
orf1
O
SO 3-
orf3
HSO 33
COO- COO
O
maleilacetát
maleilacetát reduktáz
trikarbonsav ciklus
pcaH pcaG istB
72