A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el: http://biotech.szbk.u-szeged.hu

1

2

3

Biokatalizátorok

biológiai eredetű katalizátorok, melyek lehetnek

enzimek

(fehérjék, melyek reakciókat katalizálnak),

enzimkomplexek

,

egy reakciósor enzimei

végbemenő reakciókat katalizáló fehérjék) (egymás után illetve

sejtek, szervezetek

. a

biokatalizátorok vagy képesek önmaguk újraelőállítására (sejtek, szervezetek) vagy egy másik biokatalizátor segítségével egyszerűen újra előállíthatóak

4

Centrális dogma

DNS: információ hordozó RNS: információ hordozó, katalizátor Fehérje: enzim (katalizátor) + sok egyéb

Molekuláris biológia Mikro biológia Biokémia Genetika Sejtbiológia Immunológia kémiai tudományok Molekuláris biotechnológia Élelmiszer biotechnnológia

genetikailag módosított növények, állatok, fermentatív termékek

Farmakológia,

drogok, vakcinák DNS- és immundignosztika génterápia

Iparilag hasznos termékek

előállítása, aminosavak, peptidek fehérjék, metabolitok, egyéb vegyületek

Környezetvédelem,

bioremediáció, biodegradáció 6

A FEHÉRJÉK TÚLTERMELTETÉNEK ELŐNYEI

Fő ok:

Ha egy fehérjére nagy mennyiségben van szükség, és a természetben csak kis mennyiségben fordul elő, vagy az eredeti sejtvonal nehezen kezelhető, belõle fehérje csak körülményesen nyerhető.

KÖZVETLEN FELHASZNÁLÁS IPARI,

proteázok, szénhidrátbontó enzimek, lipázok, polimerázok,bioaktív peptidek, fehérjék, hormonok, farmakológiai, gyógyászati felhasználásra

KUTATÁSI CÉLOKRA

biokémiai és biofizikai vizsgálati módszerek, 3 dimenziós röntgenszerkezet, mutációs analízis,

FELTÉTEL:

A felhasználás előtt igazolni kell, hogy az eredeti fehérje és a rekombináns megfelelője biológiailag ekvivalens 7

NUKLEINSAVAK

DNS

- genetikai információ hordozó az élőlények összes biológiai sajátságához szükséges információ genomi könyvtárak, genom projektek: ezen információk megfejtése  módosítható  genetikailag módosított élőlények (genetically modified organisms (gmo))  metabolikus utak befolyásolása  rekombináns termékek előllítása

ELŐFORDULÁS

Prokarióták kromoszóma, nincs sejtmag extrakromoszómális elemek, plazmidok, fágok Eukarióták kromoszóma, sejtmag mitokondrium kloroplaszt egyéb extrakromoszómális elemek, plazmidok vírusok

RNS tRNS transzfer RNS aminosav szállítás mRNS messenger RNS rRNS riboszómális RNS aktív transzkripció cDNS könyvtárak funkcionális genomika

8

DNA RNA

H U

3

OH OH

2

OH OH

1 9

A DNS felépítése

10

DNS-olvadáspont

Streptococcus DNS olvadási görbéje.

T

m

= az a hőmérséklet ahol a 50% DNS megolvadt.

11

A DNS G-C tartalma és olvadáspontja közötti összefüggés

12

Annealing vagy Hibridiz áció

Lehet • DNS - DNS • DNS - RNS • RNS - RNS

13

DNS tisztítása kromoszomális, plazmid

1. Sejtfeltárás - lúgos kezelés - fagyasztás – felmelegítés - lizozimos kezelés (baktériumok) - hő - nyomás, French- press - ultrahangos szonikálás 2. Egyéb sejtalkotók eltávolítása - lipidek, poliszaharidok:  szelektív kicsapás a sejtfeltárás körülményei között  szerves extrakció, fenol-kloroform elegyével  a DNS szelektív kicsapása alkohollal - fehérjék:  fehérje bontó enzimek alkalmazása: proteináz K  szerves folyadék-folyadék extrakció, fenol-kloroform elegyével - RNS:  szelektív kicsapás LiCl oldattal  RNáz enzimek alkalmazása, 14

DNS etanollal, izopropilalkohollal kicsapható Kromoszómális DNS nagy, makroszkopikus molekula kiemelhető Minél nagyobb egy DNS, annál könnyebben törik. Kb. 20 kb – osnál nagyobb DNS erős fizikai behatásnak (vortexes kevertetés) nem tehető ki!

Egyéb tisztítási módszerek

kromatográfia, - ioncserés DEAE (dietil-aminoetil) kötés alacsony, elúció magas sókoncentráció esetén A DNS savas  ionos kölcsönhatás hordozó N + - szilikagél alapú elválasztás magas sókoncentráció mellett felkötődik a DNS, alacsony sókoncentrációnál eluálódik 15

- CsCl sűrűséggradiens centrifugálás adott koncetrációjú CsCl oldat centrifugálás során grádienst képez, a DNS a saját sűrűségének megfelelő helyre vándorol és ott megáll.

különböző konformációjú DNS-k szétválaszthatóak, nagy tisztaság

RNS tisztítása

RNS nagyon könnyen degradálódik, RNázok stabilak a tisztítás során RNáz mentesíteni kell mindent DEPC: dietil pirokarbonát O O O O O 16

RNS tisztítása

sok eltérő protokol, ma univerzálisan használható rendszer a guanidium isotiocianát-fenol kloroform oldattal történő extrakció egy lépésben sejtfeltárás és szerves-vizes folyadék fázisú extrakció.

A vizes fázis csak totál RNS-t tartalmaz ( és némi kromoszómális DNS szennyezést, DNázI kezeléssel eltávolítható [S] N + NH NH 2 N guanidin és izotiociánsav sója

17

mRNS tisztítás

eukarióták esetén stabil poliA farok mRNS rRNS mRNS tRNS AAAAAAAAA TTTTTTTTTT h o r d o z ó magas só alacsony só h o r d o z ó mRNS AAAAAAAAA 18

DNS ELVÁLASZTÁSA, ELEKTROFORÉZIS

denaturáló

lúgos, (DNS, agaróz) formaldehid, glioxál, DMSO (RNS, agaróz) urea (DNS, akrilamid) méret Mátrix

nem-denaturáló

Nincs roncsoló ágens technika > 50 kb 100bp-50 kb < 1000 bp agaróz agaróz 0.5- 2% poliakrilamid pulzáló gélelektroforézis hagyományos gélelektroforézis (5-20%) hagyományos

LÁTHATÓVÁ TÉTEL:

etídium bromid, interkaláló festék  nem-denturáló körülmények, első sorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is.

A DNS 254 nm-en elnyel Érzékenység kb 10 ng  energia a festékre  590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel el Lehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni.

Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülmény között radioaktivitás: minden körülmény között, 35 S, 33 P, 32 P beta sugárzók 19

Az agaróz szerkezete

etidium bromid & DNS

20

Horizontális gélelektroforézis 21

Géldokumentáció

22

23

Vertikális gélelektroforézis (PAGE)

24

DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL

25

DNS/ RNS MÉRÉSE

A különböző nukleotidoknak 260 nm körül erős abszorbanciájuk van.

Egyszálú DNS esetén: bázis e (cm 3 /(µmol * cm) dA dG dC dT 15.4

11.7

7.5

8.8

átlagosan e = 10 (cm 3 /(µmol * cm) Ez leginkább oligonukleotidok esetén használatos.

Nagyobb egyszálú, kétszálú DNS-k, RNS-k esetén a bázisok kölcsönhatásamiatt a számítás módosul 1 cm-es küvettában 260 nm-en 1.0 az abszorbanciája 50 µg/ml kettősszálú DNS-t 33 µg/ml egyesszálú DNS-t 40 µg/ml egyesszálú RNS-t tartalmazó oldatnak A fehérjék 280 nm-en nyelnek el. Az A 260nm /A 280nm arány a nukleinsav tisztaságára jellemző A 260nm /A 280nm  2  tiszta a preparátum A 260nm /A 280nm  1 - 1,5  sok a fehérje szennyezés Egyéb módszerek: fluoreszcein, kemilumineszcens festékekkel. Érzékenyebb, de fluorimétert igényel.

26

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK

RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK

II típus Speciális célszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében pl. EcoRI Mg2+ kell Ez a típus az elterjedt 27

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK

RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK

Enzim

Alu

I

Hph

I

EcoR

I

Bam

HI Felismerőhely hossza 4 Felismerő-hasítóhely AG/CT Forrás organizmus

Arthrobacter luteus

5 6 6 GGTGAN 8 / G/AATTC G/GATCC

Haemophilus parahaemolyticus Escherichia coli Bacillus amyloliquefaciens

Ragadós végeket adó hasítások (sticky end)

5' túlnyúló

Sal

I

3' túlnyúló

Kpn

I 6 6 5' G TCGAC 3' 3' CAGCT G 3'

Streptomyces albis Hae

III 4 5' GGTAC C 3' 3' C CATGG 5'

Klebsiela pneumonia

Tompa végű hasítások (blunt end)

5' GG CC 3' 3' CC GG 5'

Haemophilus aegyptus

28

Palindrom példák

KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT NEM KERESIK 29

DNS METILÁZOK

A restrikciós enzimek lehetnek metiláció érzékenyek, érzéketlenek és függők

- dam metiláz (dezoxiadenin metiláz)

5’ GATC 3’ felismerő hely N 6 pozícióban metilez N N N adenin N N -dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz) 5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C 5 pozícióban metilez N N N citozin O 30

,Metilázok hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek pl. M. EcoRI metiláz 31

Polimerázok

- DNS függő DNS polimerázok - RNS függő DNS polimerázok - Templátfüggetlen DNS polimeráz - DNS függő RNS polimeráz 5’  3’ polimeráz aktivitás 32

Polimerázok

- DNS függő DNS polimerázok - RNS függő DNS polimerázok - Templátfüggetlen DNS polimeráz - DNS függő RNS polimeráz 5’  3’ polimeráz aktivitás 33

DNS függő DNS polimerázok

34

DNS jelölés, nick transzláció Random priming 35

DNS függő termofil DNS polimerázok

Templát független DNS polimeráz

37

RNS függő DNS polimeráz: Reverz transzkriptáz

38

DNS függő RNS polimerázok

Nukleinsav összekötő enzim: a ligáz

A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tud összekapcsolni, ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni 42

A klónozás fogalma

Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségével gazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunk Szubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása Hasítás, A,B enzimekkel A B vektor

ligálás

A inszert Hasítás, A,B enzimekkel B Transzformálás, felszaporítás, tisztítás Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni, Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.

Bacterial chromosome Plasmid Recombinant DNA (plasmid) Recombinate bacterium Copies of gene Basic research on gene Bacterium Gene of interest Cell containing gene of interest Gene of interest DNA of chromosome

3

Protein expressed by gene of interest Protein harvested Basic research on protein

Figure 20.2

Gene for pest resistance inserted into plants Gene used to alter bacteria for cleaning up toxic waste Protein dissolves blood clots in heart attack therapy Human growth hormone treats stunted growth 48

KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT VEKTORTÍPUSOK

plazmidok fonalas fágok fagemidek l fágok kozmidok BAC, YAC példa pUC18,19 mp18, 19 pBluescriptKS, SK± EMBL3,4 pHC79 pBAC108L, pYAC3 BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome inszert méret < 10 - 15 kb < 5 - 10 kb < 10 - 15 kb néhányszor 10 kb néhányszor 10 kb néhány 100 kb

PLAZMIDOK rezisztencia marker replikációs origo ORI

Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek

NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM

antibiotikum működési mód a rezisztencia módja koncentráció (µg/ml) ampicillin klóramfenikol kanamicin tetraciklin bakteriocid, sejt fal szintézis inhibitor bakteriosztikus, fehérje szintézis inhibitor, kölcsönhat az 50S riboszoma alegységgel a  laktamáz elhidrolizálja az ampicillin  laktám gyűrűjét klóramfenikol acetiltranszferáz (cat) acetilálja a klóramfenikolt bakteriocid, fehérje szintézis inhibitor aminoglikozid foszfotranszferáz illetve nukleotidtranszferáz foszforilálja vangy adenilálja a kanamicint bakteriosztatikus, proteinszintézis inhibitor, gátolja az aminoacil-tRNS kötődését a riboszómához a sejt permeabilitásának csökkentésével a tetraciklin nem tud bejutni a sejtbe 50 -100 20 30 - 500 15

PÉLDÁK PLAZMID REPLIKONOKRA

PLAZMID INKOMPATIBILTÁSI CSOPORT KÓPIASZÁM GAZDASPECIFICITÁS pBR322 pUC19 F plazmid pRK356 (R1, R6) pRK2501 (RK2)

ColE1 ColE1 FI FII P 20 300 1-2 2 1-4 E. coli és még néhány E. coli és még néhány E. coli és még néhány E. coli és még néhány

RSF1010 pRK353 (R6K) P1

Q X Y



10 13-40 1-2 Gram-negatív baktériumokban széles Gram-negatív baktériumokban széles Gram-negatív baktériumokban széles Gram-negatív baktériumokban széles

Egy ősi plazmid: pBR322

Magas kópiaszámú változat: pUC19

Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása -antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges - kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható - plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos - polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus gyors ha nincs más szelekció - kék fehér színszelekció, - pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént  megszűnik a letalitás - auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén

Kolónia hibridizáció 55

LacZ

a

komplementáció

56

LacZ

a

komplementáció

F' plazmidon: defektív  - galaktozidáz gén, hiányzik 11- 41. aminosav közötti régió bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiót és az 1-146 aminosavat a kettő együtt: aktív   – galaktozidáz X-gal szubsztráttal kék telep a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad) ebbe lehet klónozni fragmentumot, ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el  X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment  X-gal szubsztráttal fehér telep

Egy pozitív szelekciós vektor

Vektor önligálását, üres vektorok képződését gátló módszerek - kondicionálisan letális gének használata - vektor defoszforilálása -korrekt vektor/inszert arány megválasztása A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tud összekapcsolni, ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni

PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI 1. Kémiai transzformálás

Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejt A sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük, sejtfal permeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNS elvi szám a transzformációt  1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre normál érték: 10 6 nagyon jó: 10 9 – 10 8

Elektroporáció

A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású  600  ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-ig transzformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (10 10 /µg DNS) 61

Transzformálás hatékonyságát meghatározó tényezők II.

hősokk hőmérséklete, hossza plazmid mérete permealizáló ágens tárolhatóság

KONJUGÁCIÓ

Sejtből sejtbe történő DNS átadás lépései: párosodás: speciális kontaktus a donor és a recipiens között egy speciális sejtfelszíni ponton keresztül (pl. pilus) DNS átjuttatását közvetítő folyamatok, replikcáció (rolling circle, az egyik szál átjutása) konjugációs elemek donorból donort csinál az első ilyen a a szex faktor, F episzóma másik: IncP a csoportba tartozó: RP4, RK2 plazmidok (szilárd fázishoz mobilizálható plazmidok a recipiensből nem lesz donor a plazmid tartalmazza a DNS processzáló apparátust, oriT, mob régió tra gének, pilus: N-acetilált TraA

A KONJUGÁCIÓ MECHANIZUMSA

F pilus + F sejt F sejt az F plazmid eltörik 5’ 3’ a DNS egyik szála átmegy a recipiensbe, mialatt a donorba a másik szál szintetizálódik 5’ 5’ DNS szintézis a recipiensben 3’ 3’ A DNS szintézis befejezõdik a sejtek szétválnak + F sejt F pilus 5’ 5’ + F sejt

A DNS transzfer mechanizmusa a konjugáció során donor recipiens donor recipiens 5’ TraI Töréspont, nick ’ 5 TraI donor 5’ recipiens Egyszálú DNS kötő fehérje TraC primáz RNS primer Replikatív DNS polimeráz TraI

Donor

tra

RP4

mob

Konjugatív génátviteli stratégiák Akceptor konjugáció

elõtt után

+

A konjugáció célja “sima” konjugáció

RP4 tra

mob

RP4 tra Tn5

mo b

-

Irányított mutagenezis, homológ rekombináción alapuló integráció Random, transzpozon alapú mutagenezis

Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis

Ar1 oriV oriT

oriV: szűk gazdaspecificitás

Ar2 Ar: antibiotikum rezisztencia Ar2 oriT oriV Ar1

vad típus

Ar2

mutáns poláris hatás

Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül

Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia oriT oriV Ar1

vad típus mutáns poláris hatás ?

Fonalas fágok I.

M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül: RF, replikatív forma  ez alkalmas genetikai manipulációkra A fág genomjának 90%-a 10 fehérjét kódol, nagyobb intergenikus régió a VIII és a III gének illetve II és IV gének között, regulátor funkció A fág a szexpiluson keresztül fertőz, a DNS (+) szál jut be a sejtbe  lesz kétszálú replikatív forma 15-20 perc, 100-200 kópia ebből Nem öli meg a gazdasejtet, csak lassítja a növekedést VIII fehérje a fő strukúr protein, 2700 kópia, a III. számú fehérje a filament végén néhány kópiában Az RF forma képződése után transzkripció, transzláció, Replikáció: II fehérje töréspontot idéz elő, DNS polimeráz I polimerizál WC papír modell. a II. fehérje vagdossa egységnyi darabokra V. fehérje: egyszálú DNS kötő fehérje, represszálja a II gén expresszióját  kópiaszám kontroll 69

70

A fonalas fágok életciklusa

71

Fonalas fágok II.

A fág nem a sejten belül szerelődik össze, hanem a genom az V. fehérje a (+) szálhoz kapcsolódva vándorol a membránhoz, ott a DNS a membránon keresztüljutva beburkolódik a kapszid fehérjékbe Nincs szoros mérethatára a pakolódásnak

Fonalas fágvektorok

500 bp a II és IV gének között nem kidobható: a (+) és (-) szál szintézisének iniciációját és terminációját befolyásolják,  független transzkripciós terminációs szignál inszerciók befolyásolják a fág replikációt, mutációk a II és IV génben kompenzálnak LacZ a komplementáció, nincs antibiotikum minireplikon kiugrása 72

Egy fonalas fág térképe

73

74

Epitóp könyvtár készítése, fág display vektorok gVIII (vagy gIII) gén (NNN) x X : 6 vagy hosszabb 75

Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése phage display technikával Az anthrax toxin érése, patogenezise, potenciális célpontok A (PA 63 ) heptamert felkötjük egy oszlopra 76

Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése phage display technikával II. TYWWLD A (PA 63 ) 7 oszlopon kromatografáljuk ACCTATTGGTGGCTGGAT DNS izolálás, szekvenálás (NNN) x elúció átfolyó specifikus felkötődik 77

Fagemidek: fonalas fágok és plazmidok hibridjei 78

A

l

fágok általános felépítése

    genetikai anyag: 40-50 kb duplaszálú lineáris DNS fertőzéssel jut a sejtbe,  nagy hatékonyság két életciklus: - lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél - lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek

EcoRI BamHI SalI EcoRI BamHI SalI bal kar 20 kb centrális régió 14 kb jobb kar 9 kb a középső, centrális régió eltávolítható

79

80

A lambda fág életciklusa 81

82

Helyettesítő/ replacement vektorok Inszerciós vektorok Lambda fág példák 83

A klónozás menete helyettesítő vektorok esetén A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

84

85

Génátvitel transzdukcióval baktériumokban fág DNS bakteriális DNS-t is tartalmazó többnyire defektív fágok intakt normál fág transzdukáló fág bakteriális fágfertőzés lizogén életciklus fág genom integrálódása a baktérium kromoszómájába a fág által hordozott bakteriális DNS beépülése rekombinációval 86

Kozmidok: plazmidok és l fágok hibridjei fertőzéssel bejuttatható plazmidok 87

88

Mesterséges kromoszómák: BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok 89

Mesterséges kromoszómák: YAC (yeast artificial chromosome) vektorok 90

GÉNEK ELŐÁLLÍTÁSÁNAK STRATÉGIÁI

Gének izolálása

A megfelelő organizmus génkészletéből a kívánt régiót tartalmazó szakasz valamilyen módon való kinyerése elterjedtebb, -általában gyorsabb, kevesebb munkát igényel (ha lehetséges) - nem feltétlenül szükséges szekvencia információ, de nem árt, ha van - a különböző organizmusok genom szekvenciái nagy segítséget jelenthetnek - hátrány: kodon preferencia adott, nem tervezhető

Gének szintézise

Szintetikus oligonukleotidokból történő összeépítés - kevésbé elterjedt - a gén hosszától függően sok munkát igényelhet, - a fehérje elsődleges szekvenciáját ismerni kell - előny: tervezhető a biológia szabályainak figyelembevételével, - az optimális kodon felhasználás a gazda sejthez igazítható, az optimális fehérje túltermeltetési tapasztalatok jobban kamatoztathatók 91

kolónia plakk

KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI

- genomiális - cDNS

a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz (pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok) mind prokariótákból, mind eukariótákból az aktívan termelődő mRNS-ekből készül csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza (nincs intron szabályozó régió stb) csak eukariótákból

expressziós

a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk, ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet

Követelmények a könyvtárakkal szemben

- fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt - ne legyen redundáns 92

GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA

bal kar hasító helyek jobb kar centrális régió bal kar emésztés jobb kar részleges vagy 20-24 kb méretű teljes emésztés fragmentek ligálás konkatamer

in vitro pakolás: összekeverés

l

fágfehérje extraktummal

A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

93

Genomiális könyvtár készítése kozmidban

Eco Bam

RI HI

Hind

III

Cla

I Amp r c2RB 6.8 kb Km r cos cos

Sma

I  Genomi DNS részleges emésztése Sau3A-val (a Sau3A kompatibilis véget ad a BamHI-gyel  A 30 – 45 kb régió méret szerinti elválasztása ori BamHI- SmaI emésztés cos cos Amp r ori ligálás 30 – 45 kb-os fragmentek cos cos in vitro pakolás fertőzés l fehérje extraktummal, szelekció ampicillin rezisztens klónokra

kozmid könyvtár

94

Bakteriális shot-gun könyvtár készítése

transzformálás

E. coli

elektroporálás kromoszómális DNS nebulizátor összetört DNS 2-3,5 kb fragmentek végek tompítása defoszforilálás Preparatív gél elektroforézis 95

cDNS könyvtár A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények

 Integritás  A mRNS mérete, degradált-e Megoldás: denaturáló gélelektroforézis (várt méret 0.5 - 8 kb, a többség 1.5 -2 kb)  Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal elektroforézis  Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal  A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció 96

A cDNS könyvtár mérete  A kérdéses mRNS előfordulási gyakorisága 10000 - 30000 különböző mRNS emlős sejtekben  nagy gyakoriságú 50 - 90 %, pl. globin nem problematikus  kis gyakoriságú  0.5 % nagy könyvtárat kell készíteni, és a detektálás is gond N = ln(1-P) / ln(1-1/n) N: a szükséges klónok száma a könyvtárban, P: annak a valószínûsége, hogy a keresett klón benne legyen a könyvtárban, 1/n: az a mRNS frakció, ami 1 db keresett mRNS-t tartalmaz immunoprecipitált in vitro transzlált termék/ összes transzlált termék pl. 14 molekula/sejt,  1/n = 37000, P= 0.99, N= 170000 97

cDNS könyvtár

mRNS-ekről készül – általában eukarióta forrás - Ezeknek van stabil AAAAAAAA szekvenciájuk a 3’ végen 98

cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel 99

5' Szubsztraktív hibridizáció nem indukált minta, mRNS tisztítás indukált minta, mRNS tisztítás reverz transzkripció biotin

TTTTTTTTT AAAAAAAAA 3'

RnázH B SA B B B immobilizált streptavidin B SA B SA cDNS könyvtár átfolyó csak indukált mRNS hibridizáció cDNS, jelölés 100

RENDELKEZÉSRE ÁLLÓ VAGY SZÜKSÉGES INFORMÁCIÓK A KERESETT FEHÉRJÉRŐL, ILLETVE GÉNJÉRŐL

csak fenotípus alapján jellemezhető

mutagenezis (transzpozon) kromoszomális séta

már van ilyen fehérje illetve gén más típusú sejtekből

- nem tudunk semmit -

ismeretek a fehérje funkciójáról

heterológ próba használata könyvtárak átvizsgálásához

van tisztított fehérje

fehérje funkció tesztelhető expressziós könyvtárak fehérje szekvenálás  DNS próba tervezés ellenanyag termeltetés expressziós könyvtárak EGYÉB pl. ha a fehérje szabályozása ismert  szubsztraktív hibridizáció -

számítógép, adatbankok

genom szekvenálások

POZITÍV KLÓNOK KÜLÖNBÖZŐ KÖNYVTÁRAKBÓL VALÓ KIVÁLASZTÁSÁRA SZOLGÁLÓ MÓDSZEREK

kolónia vagy plakkhibridizáció, jelölt DNS-sel

DNS próba előállítása:

- szintetikus (degenerált) oligonukleotidok - megfelelően választott primerekkel elôállított PCR fragment - izolált DNS fragment (lehet heterológ is)

Jelölési módszerek

- radioaktív vagy nemradioaktív - 5' foszforilálás, vagy 3' végen feltöltéses végjelölés vagy terminális transzferázzal, "nick-transzláció", "random priming", PCR honnan lehet próbánk:  a gén már ismert, legalábbis egy darabon   heterológ próba: más mikroorganizmusokból már ismert hasonló géne van tiszított fehérjénk   fehérje szekvenálás DNS próba tervezés reverz transzlációval

A keresett gén kiválasztása a könyvtárból Ha van DNS próbánk 103

cDNS-ből készült expressziós könyvtárból

- Immunológiai detektálás poli- vagy monoklonális ellenanyaggal - Aktivitás mérés (csak bizonyos szerencsés esetekben) - Valamilyen módon jelölt liganddal (ha van a keresett fehérjének) 104

Keresett gének kiválasztása expressziós könyvtárból

Ha van a keresett fehérjét felismerő ellenanyagunk

105

ÉLESZTŐ KÉT HIBRID RENDSZER

fehérje-fehérje kölcsönhatáson alapuló szelekció GAL4 transzkripciós aktivátor DNS kötő domén (DKD) aktivátor régió (AR) Protein X DKD GAL4 kötő hely

lacZ

AR Protein Y Protein X DKD AR Protein Y GAL4 kötő hely

lacZ

kölcsönhatás esetén: kék telepek

BAKTERIÁLIS KÉT HIBRID RENDSZER

Protein X DKD GAL4 kötő hely

lacZ

Protein Y RNS pol.

Protein X DKD Protein Y RNS pol kölcsönhatás esetén: kék telepek

lacZ

GAL4 kötő hely

pozitív szelekció, nagyobb könyvtárakra

Protein X DKD Protein Y RNS pol kölcsönhatás esetén: növekedés hisztidin mentes táptalajon GAL4 kötő hely

his3

A POZITÍV KLÓNOK TOVÁBBI FELDOLGOZÁSA

A könyvtárakból kapott klónok általában túl nagyok közvetlen felhasználáshoz, ezért további munkálatok szükségesek: 1. AZ INSZERT RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉSE 2. A TÉRKÉP ALAPJÁN AZ INSZERT KISEBB DARABOKBAN TÖRTÉNŐ SZUBKLÓNOZÁSA 3. AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 4. AZ INSZERT SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 5. SZÁMÍTÓGÉPES ADATFELDOLGOZÁS A SZEKVENCIÁN BELÜLI GÉNEK, ELEMEK AZONOSÍTÁSA

RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉS

Klónozás, szubklónozás Hasítás, A,B enzimekkel A B vektor A A B C

ligálás

A inszert Hasítás, A,B enzimekkel B Transzformálás, felszaporítás, tisztítás

A POZITÍV KLÓNOK TOVÁBBI FELDOLGOZÁSA

A könyvtárakból kapott klónok általában túl nagyok közvetlen felhasználáshoz, ezért további munkálatok szükségesek: 1. AZ INSZERT RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉSE 2. A TÉRKÉP ALAPJÁN AZ INSZERT KISEBB DARABOKBAN TÖRTÉNŐ SZUBKLÓNOZÁSA 3. AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 4. AZ INSZERT SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 5. SZÁMÍTÓGÉPES ADATFELDOLGOZÁS A SZEKVENCIÁN BELÜLI GÉNEK, ELEMEK AZONOSÍTÁSA

AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA

A POZITÍV KLÓNOK TOVÁBBI FELDOLGOZÁSA

A könyvtárakból kapott klónok általában túl nagyok közvetlen felhasználáshoz, ezért további munkálatok szükségesek: 1. AZ INSZERT RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉSE 2. A TÉRKÉP ALAPJÁN AZ INSZERT KISEBB DARABOKBAN TÖRTÉNŐ SZUBKLÓNOZÁSA 3. AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 4. AZ INSZERT SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 5. SZÁMÍTÓGÉPES ADATFELDOLGOZÁS A SZEKVENCIÁN BELÜLI GÉNEK, ELEMEK AZONOSÍTÁSA

AZ INSZERT SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA

átfedő szekvenciákból, két szálon szekvenált régiókból kontig összerakás kék: szubklónozás, rózsaszín: primer séta

TCH6-VEG

(8691 bps) TCH64sk X1O1 TCX66T3 TCX54t3 X1O7 TCX75t7 TCH6SK TCH64uni TCH6uni O20 O15 O16 TCH13T7 TCX81 O10 O13 O12 2000 O9 X1UNI TCX34t3 TCX52t7 X1O5 4000 X1O2 X1O4 X1O6 TCX81t3 X1O3 TCX75T3 6000 X1O8 X1T3 TCH5uni TCB4T3 O14 8000 pTCX1 pTCB4/2

De ha sikerül, és van szekvenciánk Mi van rajta,van-e gén? Honnan tudjuk, hogy Valamit találtunk, találtunk-e gént?

CTCGAGACGCTGTTTCTGGGGTCATTCATTCTTGGCGGGCTGCAACTGCTGGTGTGACCGACGCGACCTGGCAGGCCGCGGTGCGCAACTGGCCGGGCGGACTAATGGTGGAGCAAAAGA TCGGCATGTCCAGCGCACCTGAAGCTTGGGTGGTTGCTGCAATAGCAGCCTTCCTTATTGGCATGGCGAAGGGCGGTTTGGCCAATGTGGGGGTTATCGCCGTTCCCTTGATGTCCCTGG TCAAGCCGCCGCTTACCGCTGCCGGATTGCTGCTCCCGATCTATGTCGTTTCTGATGCATTCGGCGTCTGGCTTTATCGGCACCGGTATTCTGCCTCCAATCTGCGCATCCTGATTCCTT CGGGATTTTTTGGGGTCCTGATTGGCTGGTTATTGGCCGGGCAGATCTCCGACGCGATTGCCAGTGTCATTGTTGGTTTCACCGGCTGCGGCTTCGTGGCTGTGCTGCTGGCACGACGAG GGGTGCCATCGGTGCCGCGTCAAGCCAACGTGCCCAAAGGATGGTTTCTGGGGGTGGCCACCGGCTTTACCAGCTTTTTGACTCATTCCGGTGCGGCGACCTTCCAGATGTTCGTGCTGC CGCAACGGCTGGACAAGACCATGTTCGCGGGCACATCAACGCTTACCTTTGCTGCCATAAACCTATTCAAGATTCCGTCCTACTGGGCATTGGGACAGCTTTCGACTTCCTCGGTCATGT CCGCGCTAGTGTTGATTCCGGTGGCCGTGGCCGGGACGTTCGCAGGTGTTTTTGCGACGCGCAGGCTATCGACATCCTGGTTCTTCATTCTGGTCCAGGCGATGTTGCTGGTGGTCTCCA TTCAGCTTCTGTGGAGGGGAATGTCGGATATCCTGAACTAGCTGGAGATCGCAATGTCAGAACGCTCAATCAATCAGAATGTAATCTTGACATAGAATACCGTTCCGATTTATTGCTTCG AGTGAAGCTGCCCGTCCGCTGAGATGTCATGACATTTTCCCCGCTTGATTCCGCCCTGCTTGGACCGTTGTTCGCGACCGATGAAATGCGCACGGTCTTCTCCGAACGGCGTTTTTTGGC GGGAATGCTTCGTGTTGAAGTGGCCCTGGCGCGCGCGCAGGCGGCAGAGGGCCTTGTCAGTTCGGAATTGGCCGACGCGATCGAGGTTGTTGGTACTGCCGGGTTGGACCCCGAGGCGAT GGCGGCGACTACTCGCATGACAGGAGTGCCCGCAATATCGTTCGTCCGTGCGGTGCAATCGGCCCTGCCGCCCTCACTGGCGGGTGGATTTCATTTCGGCGCCACCAGTCAAGACATCGT GGATACGGCCCACGCGCTCCAGCTGGCCGAGGCACTCGATATTATAGAAGTCGATTTACACGCCACTGTCAGCGCAATGATGAATCTGGCCGCTGCTCACTGCAATACACCCTGTATCGG GCGCACGGCCTTGCAGCACGCAGCGCCAGTTACGTTCGGCTACAAGGCGTCCGGCTGGTGCGTTGCCCTGGCGGAGCATCTGGTGCAGCTTCCCGCGCTGCGAAAGCGGGTTCTGGTGGC GTCGCTAGGGGGGCCGGTTGGTACCCTTGCCGCGATGGAGGAGCGGGCCGACGCTGTACTGGAGGGTTTCGCTGCGGACCTGGGGTTGGCCATTCCCGCCCTGGCCTGGCACACGCAGCG GGCCCGGATCGTCGAGGTGGCCAGTTGGCTGGCCATATTGCTGGGAATTCTGGCAAAAATGGCCACCGATGTCGTTCACTTGTCCTCCACGGAAGTGCGCGAGCTTTCCGAACCTGTAGC GCCGGGCAGGGGGGGCTCCTCGGCGATGCCTCACAAGCGGAACCCGATTTCCTCGATTACCATCCTGTCCCAGCATGCTGCGGCAGGGGCCCAGCTCTCCATTCTCGTGAACGGCATGGC CAGTCTGCACGAACGTCCGGTGGGGGCGTGGCATTCGGAATGGTTGGCTCTGCCGACGCTGTTCGGCCTTGCCGGCGGTGCCGTGCGCGAGGGCAGGTTTCTGGCCGAGGGGCTGCTGGT CGATGCCGACCAGATGGGTCGCAATCTACAATTGACCAATGGCCTGATTTTCAGCGACGCGGTAGCCGGCCAGTTGGCAAAGCACTTGGGTCGGGCCGAGGCTTATGCCGCTGTCGAGGA TGCCGCCGCCGAGGTGTTGCGTTCAGGCGGCAGCTTTCAGGGTCAGCTGAACCAGCGCCTGCCCGATCACCGCGACGCTATCGCTATTGCTTTTGATACGACGCCGGCGATCCAGGCCGG GGCCGCCCGCTGCCGTAGTGCGCTGGATCATGTGGCTCGTATTCTTGGACCCGCCTCTACCATCGGATTTCAAGGAGGCTAATGACGTGACGACACTGTTTGAGGCGACGACCATCCCGA TTTGCGAGGGCCCGCGCGACCAGACCGCCGAGATCCTTTTCGAGATGCCGCCGGGTGCGTGGGATACCCATTTTCATGTTTTTGGCCCAGTTTCATCGTTTCCATACGCAGAACACAGGC TCTATTCCCCACCGGAGTCGCCACTTGAGGATTATCTGGTGTTGATGGAGGCTTTGGGGATCGAGCGCGGCGTTTGTGTCCATCCGAATGTTCATGGTGCCGACAATTCGGTGACGCTCG ACGCAGTTGCGCGGTCCGATGGTCGTCTGCTGGCGGTGATCAAGCCACATCACGAGATGACTTTTGTTCAGCTGCGGGACATGAAGGCGCAGGGGGTCTGCGGGGTACGTTTTGCCTTCA ATCCGCAGCATGGCTCGGGCGAGTTGGATACTCGTTTGTTCGAGCGTATGTTGGACTGGTGCCGCGACCTAGGCTGGTGCGTAAAATTGCATTTCGCGCCCGCTGCGCTGGACGGTCTGG CTGAACGTTTGGCGCGCGTCGATATTCCGATCATCATCGATCATTTCGGGCGGGTGGACACCGCGCAAGGTGTGGATCAGCCGCACTTCCTGCGTTTGCTCGATCTGGCCAAACTGGACC

HONNAN LEHET TUDNI, HOGY GÉNT TALÁLTUNK?

1. DNS szekvencia homológia alapján Adatbankok, FASTA, BLAST 2. ORF KERESÉS, Általában ATG-vel kezdődő szakaszokat keresünk, amelyek ésszerűen hosszúak (100 aminosav) Clone Manager 3. A kapott ORF-k homológia kutatása Adatbankok, FASTA, BLAST

Fehérjeszekvenciák összehasonlítása

HONNAN LEHET TUDNI, HOGY GÉNT TALÁLTUNK?

4. Ha rendelkezésre áll a keresett fehérjének N-terminális szekvenciája, akkor az azzal való összevetés 5. Funkcionális analízis - a kapott polipeptidet expressziós kazettába illesztjük, és a kapott termék aktivitását teszteljük mutáns törzs komplementáció ja fehérjével az expressziós kazettában termeltetett 5. Immunológiai teszt Expressziós kazettában termelt fehérjét a tisztított fehérje ellen termeltetett ellenanyaggal, Western blot-tal analizálunk 6. Bakteriális gének esetén a T7 RNS polimeráz alapú rendszerekkel