Transcript Fonalas fágvektorok

Fonalas fágok I.
M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással
Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül: RF, replikatív
forma  ez alkalmas genetikai manipulációkra
A fág genomjának 90%-a 10 fehérjét kódol, nagyobb intergenikus régió a VIII
és a III gének illetve II és IV gének között, regulátor funkció
A fág a szexpiluson keresztül fertőz, a DNS (+) szál jut be a sejtbe  ebből
lesz kétszálú replikatív forma 15-20 perc, 100-200 kópia
Nem öli meg a gazdasejtet, csak lassítja a növekedést
VIII fehérje a fő strukúr protein, 2700 kópia, a III. számú fehérje a filament
végén néhány kópiában
Az RF forma képződése után transzkripció, transzláció,
Replikáció: II fehérje töréspontot idéz elő, DNS polimeráz I polimerizál
WC papír modell. a II. fehérje vagdossa egységnyi darabokra
V. fehérje: egyszálú DNS kötő fehérje, represszálja a II gén expresszióját
 kópiaszám kontroll
1
2
A fonalas fágok életciklusa
3
Fonalas fágok II.
A fág nem a sejten belül szerelődik össze, hanem a genom az V.
fehérje a (+) szálhoz kapcsolódva vándorol a membránhoz, ott a
DNS a membránon keresztüljutva beburkolódik a kapszid
fehérjékbe
Nincs szoros mérethatára a pakolódásnak
Fonalas fágvektorok
500 bp a II és IV gének között nem kidobható:
a (+) és (-) szál szintézisének iniciációját és terminációját
befolyásolják,  független transzkripciós terminációs szignál
inszerciók befolyásolják a fág replikációt, mutációk a II és IV
génben kompenzálnak
LacZ  komplementáció, nincs antibiotikum
minireplikon kiugrása
4
Egy fonalas fág térképe
5
6
Epitóp könyvtár készítése, fág display vektorok
gVIII (vagy gIII) gén
(NNN)x
X : 6 vagy hosszabb
7
Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése
phage display technikával
Az anthrax toxin érése, patogenezise,
potenciális célpontok
A (PA63) heptamert felkötjük
egy oszlopra
8
Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése
phage display technikával II.
TYWWLD
ACCTATTGGTGGCTGGAT
A (PA63)7 oszlopon kromatografáljuk
DNS izolálás,
szekvenálás
(NNN)x
elúció
specifikus felkötődik
átfolyó
9
Másik példa: monoklonális ellenanyagok előállítása
pIII fág display technikával
Egy demonstrációs anyag a pIII alapú fág display technikára:
http://www.dyax.com/discovery/phagedisplay.html
10
Fagemidek:
fonalas fágok és plazmidok hibridjei
11
A  fágok általános felépítése
 genetikai anyag: 40-50 kb duplaszálú lineáris DNS
 fertőzéssel jut a sejtbe,  nagy hatékonyság
 két életciklus:
- lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél
- lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak
 a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek
bal kar 20 kb
EcoRI
BamHI
SalI
centrális régió 14 kb
jobb kar 9 kb
cos
cos
EcoRI
BamHI
SalI
a középső, centrális régió
eltávolítható
12
13
A lambda fág életciklusa
14
15
Lambda fág példák
Helyettesítő/
replacement
vektorok
Inszerciós
vektorok
16
A klónozás menete helyettesítő vektorok esetén
A pakolódás feltétele, hogy a
rekombináns gemon mérete a
vad típus méretének
79 – 105 %- a lehet.
17
Szelekciós elvek  fágok esetén
bepakolódási szabály: vad típusú  fág méretének 79-105%
18
19
Génátvitel transzdukcióval baktériumokban
bakteriális DNS-t is
tartalmazó többnyire
defektív fágok
fág DNS
intakt normál fág
transzdukáló fág
bakteriális
fágfertőzés
lizogén életciklus
fág genom integrálódása a
baktérium kromoszómájába
a fág által hordozott
bakteriális DNS beépülése
rekombinációval
20
Kozmidok:
plazmidok és  fágok hibridjei
fertőzéssel bejuttatható plazmidok
21
22
Mesterséges kromoszómák:
BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok
23
Mesterséges kromoszómák:
YAC (yeast artificial chromosome) vektorok
24
GÉNEK ELŐÁLLÍTÁSÁNAK STRATÉGIÁI
Gének izolálása
A megfelelő organizmus génkészletéből a kívánt régiót tartalmazó szakasz
valamilyen módon való kinyerése
elterjedtebb,
-általában gyorsabb, kevesebb munkát igényel (ha lehetséges)
- nem feltétlenül szükséges szekvencia információ, de nem árt, ha van
- a különböző organizmusok genom szekvenciái nagy segítséget jelenthetnek
- hátrány: kodon preferencia adott, nem tervezhető
Gének szintézise
Szintetikus oligonukleotidokból történő összeépítés
- kevésbé elterjedt
- a gén hosszától függően sok munkát igényelhet,
- a fehérje elsődleges szekvenciáját ismerni kell
- előny: tervezhető a biológia szabályainak figyelembevételével,
- az optimális kodon felhasználás a gazda sejthez igazítható, az optimális fehérje
túltermeltetési tapasztalatok jobban kamatoztathatók
25
KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI
- genomiális
- cDNS
a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz
(pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok)
mind prokariótákból, mind eukariótákból
az aktívan termelődő mRNS-ekből készül
csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza
(nincs intron szabályozó régió stb)
csak eukariótákból
expressziós
a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk,
ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet
Követelmények a könyvtárakkal szemben
- fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt
- ne legyen redundáns
26
GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA
hasító helyek
bal kar
centrális régió
bal kar
jobb kar
emésztés
jobb kar
részleges vagy
teljes emésztés
20-24 kb méretű
fragmentek
ligálás
konkatamer
in vitro pakolás: összekeverés  fágfehérje extraktummal
A pakolódás feltétele, hogy a
rekombináns gemon mérete a
vad típus méretének
79 – 105 %- a lehet.
27
Genomiális könyvtár készítése kozmidban
BamHI
HindIII
EcoRI
ClaI
cos
Ampr
c2RB Kmr
6.8 kb
SmaI
Genomi DNS részleges
emésztése Sau3A-val
(a Sau3A kompatibilis véget
ad a BamHI-gyel
A 30 – 45 kb régió méret
szerinti elválasztása
cos
ori
BamHI- SmaI emésztés
cos
cos
Ampr
ori
ligálás
30 – 45 kb-os fragmentek
cos
cos
in vitro pakolás 
fehérje extraktummal,
fertőzés
szelekció ampicillin rezisztens klónokra
kozmid könyvtár
28
PARCIÁLIS GENOMI KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSE
csak akkor, ha van hibridizációs próbánk
Előzetes Southern
M
A
B
A+B
M
C
D
C+D
Preparatív gél elektroforézis
AB
A+B
vektor
hasítás A+B-vel
izolálás,
M
defoszforilálás
Southern
1
2
3
A
2. frakció
B
ligálás
részleges könyvtár
29
Southern blot és hibridizáció
30
Bakteriális shot-gun könyvtár készítése
E. coli
transzformálás
kromoszómális DNS
elektroporálás
nebulizátor
2-3,5 kb
fragmentek
végek
tompítása
összetört DNS
defoszforilálás
Preparatív gél elektroforézis
31
A KROMOSZÓMÁLIS SÉTA
Cél
Ismert marker 1.
Ismert marker 2.
1. klón
: EcoRI
: BamHI
2. klón
3. klón
: HindIII
: PstI
4. klón
: SmaI
32
A KROMOSZÓMÁLIS SÉTA II
33
cDNS könyvtár
A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények
 Integritás
 A mRNS mérete, degradált-e
Megoldás: denaturáló gélelektroforézis
(várt méret 0.5 - 8 kb, a többség 1.5 -2 kb)
 Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni
Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal
elektroforézis
 Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni
Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal
 A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni
Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció
34
A cDNS könyvtár mérete
 A kérdéses mRNS előfordulási gyakorisága
10000 - 30000 különböző mRNS emlős sejtekben
 nagy gyakoriságú 50 - 90 %, pl. globin
nem problematikus
 kis gyakoriságú  0.5 %
nagy könyvtárat kell készíteni, és a detektálás is gond
N = ln(1-P) / ln(1-1/n)
N: a szükséges klónok száma a könyvtárban,
P: annak a valószínûsége, hogy a keresett klón benne legyen a könyvtárban,
1/n: az a mRNS frakció, ami 1 db keresett mRNS-t tartalmaz
immunoprecipitált in vitro transzlált termék/ összes transzlált termék
pl. 14 molekula/sejt,  1/n = 37000, P= 0.99, N= 170000
35
Dúsítási eljárások
Megoldás: dúsítás ( 1% alatt célszerű)
 mRNS méret szerinti elválasztása
- elektroforetikus úton
- sucrose grádiensen
minden frakciót tesztelni kell immunoprecipitációval
 cDNS méret szerinti elválasztása
könnyebb, ponotsabb
 Poliszómák immunoprecipitációja
technikailag nehéz, és csak megbízható források esetén működik
36
cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel
37
cDNS-könyvtár készítése
38
cDNS könyvtár készítése: Okayama-Berg módszer I
39
cDNS könyvtár készítése: Okayama-Berg módszer II
40
41
Biotinilálás
42
Szubsztraktív hibridizáció
nem indukált minta, mRNS tisztítás
indukált minta, mRNS tisztítás
biotin
reverz transzkripció
TTTTTTTTT
AAAAAAAAA 3'
5'
RnázH
B
SA
B
SA
B
SA
B
B
immobilizált
B
streptavidin
cDNS könyvtár
átfolyó
csak indukált mRNS
cDNS, jelölés
hibridizáció
43