Transcript szeparálás, aktivitás mérése

10. SZEMINÁRIUM
AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK
ELVÁLASZTÁSA ÉS AKTIVITÁSUK MÉRÉSE
SEJTSZEPARÁLÁS
Számunkra érdekes sejteket fizikailag elkülönítjük egy
heterogén populáció többi tagjától
A sejtek fizikai, biológiai vagy immunológiai különbözőségeit használjuk ki.
(A sejtfelszíni markerek kifejeződésének mértékében is gyakori a különbség – lehetőség
van a szeparált élő sejtek további vizsgálatára).
 fizikai – sűrűség, méret
 sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre
 immunológiai – eltérő sejtfelszíni antigének
A szeparálás eredményességét jelzi: tisztaság, visszanyerés hatékonysága, sejtek
életképessége
KÉTFÉLE SZEPARÁLÁSI STRATÉGIA
Pozitív szeparálás
elkülöníteni kívánt sejtek
megjelölése és elkülönítése a
többitől
Negatív szeparálás
a nem kívánatos sejtek
megjelölése és
megszabadulás tőlük
pl. a sejtek valamelyik sejtfelszíni molekuláját (CD markerét)
fluoreszcens ellenanyaggal jelöljük
A sejteket a szeparálási folyamat
körülményei mellett a receptorához
kötött ellenanyag direkt módon
befolyásolhatja. A pozitív szeparáció
viszont gyakran nagyobb tisztaságot
eredményez.
A szeparálandó sejtet csak a
procedúra egyéb körülményei
befolyásolják. Funkcionális vizsgálatok
esetén inkább ezt használják.
FICOLL-PAQUE SŰRŰSÉG ALAPÚ
SEJTSZEPARÁCIÓ
Perifériás vér
(vagy buffy coat)
Mononukleáris sejteket tartalmazó
„gyűrű” átpipettázása egy másik
csőbe, hogy megszabaduljunk a
Ficoll-tól
centrifugálás
plazma
Mononukleáris
sejtek
(PBMC)
ficoll
Sejtek pipettázása
a Ficollra
Neutrofil
granulociták
Vörösvértestek
Szeparált
sejtek
(from Google pictures)
(Nature Protocols http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n6/images/nprot.2008.69-F1.jpg)
A SEJTEK IMMUNOLÓGIAI TULAJDONSÁGAIN
ALAPULÓ SZEPARÁLÁSI ELJÁRÁSOK
Mágneses sejtszeparálás (MACS)
Antigén specifikus ellenanyag
Paramágneses szemcse
MÁGNES
MÁGNES
oszlop
Nem jelölt
sejtek
eltávolítása
(negatív
szelekció)
A SEJTEK IMMUNOLÓGIAI TULAJDONSÁGAIN
ALAPULÓ SZEPARÁLÁSI ELJÁRÁSOK
Fluoreszcens sejtszeparálás (FACS)
NKT sejtek
Például:
NKT sejt szeparálás (CD3/CD56)
Vér minta
NK sejtek
limfociták
T sejtek
Az áramlási cella
vibrációjának hatására a
folyadéksugár a
frekvenciától függően,
adott stabil helyen
cseppekre bomlik
cseppleszakadási pont
vibráció
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lézer
Elektromosan töltött
eltérítő lemezek
+
+
+
+
Ha a szeparálandó sejt eléri a
csepp-képződési pontot, a
folyadéksugárra elektromos töltés
kapcsolódik (arra a rövid időre),
így a leváló csepp töltötté válik.
+
+ +
+ +
- Elektromosan töltött
- eltérítő lemezek
-
--- gyűjtőcső
gyűjtőcső
szemét
AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK
AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA
FAGOCITÁLÓ SEJTEK – FAGOCITÓZIS VIZSGÁLAT
• Különböző fluorofórokkal jelöltek
elölt patogének alkalmazása
(baktériumok: E. coli, S. aureus;
élesztő: S. cerevisiae)
• A fagocitózis detektálható
fluoreszcens mikroszkóppal vagy
áramlási citometriával
LIMFOCITA AKTIVITÁS MÉRÉSE
T- és/vagy B-sejtek funkcióját érintő immundeficienciák kimutatására
A limfociták specifikus antigénnel történő aktivációja
alig detektálható (az antigénspecifikus sejtek száma
alacsony)
Poliklonális limfocitaaktivációt kiváltó anyagok segítenek
az abnormális limfocita funkciók vizsgálatában
HUMÁN T ÉS B SEJTEK
POLIKLONÁLIS AKTIVÁCIÓJA

Lektinek (pl. Concanavalin A és PHA)
receptorok keresztkötésén keresztül hatnak

Intracelluláris jelátviteli kaszkád aktivátorok
(PMA – PKC aktivátor, Ionomycin –
emelkedett intracelluláris Ca2+ szint)

Specifikus antitestek (anti-IgM, anti-CD3,
anti-TCR)
POLIKLONÁLIS T SEJT AKTIVÁTOROK
Phaseolus vulgaris
Phytohaemagglutinin (PHA)
Concanavalin A (ConA)
Anti-CD3, Anti-TCR antitestek
Canavalia ensiformis
Pokeweed (álkörmös) mitogen (PWM)
Staphylococcus protein A szuperantigén (SpA)
Epstein Barr Vírus (EBV) (transzformáló hatás)
Anti-IgM antitest
Phytolacca americana
POLIKLONÁLIS B SEJT AKTIVÁTOROK
Receptorok ligand általi keresztkötése
(pillanatszerű)
Foszforilációs lépések
Antigén receptorok (TCR, BCR),
citokin receptorok, stb.
-
Western blot
-
Áramlási citometria
Fluoreszcens
mikroszkópia
qRT-PCR  mRNS
Western blot  fehérje
Citokin szintézis
-
i.c. citometria
Citokin szekréció
- ELISA
- ELISPOT
(másodpercek-percek)
i.c. Ca2+
emelkedés
Génaktiváció
Limfocita aktiváció
A vizsgálat gyakran specifikus
antigén-ellenanyag kapcsolódáson
alapul
Életképesség/apoptózis
Sejtosztódás
-
halott sejtekre
specifikus festékek
-
3H-thymidine
CFSE
MTT
Fluo-3
vagy
Indo-1
A citoplazmatikus Ca2+
koncentráció mérése
fluoreszcens indikátor
festékekkel vizsgálható
/Fluo-3 vagy Indo-1/
Fluoreszcencia arányos az
intracelluláris Ca2+
koncentrációval
A CA2+ SZIGNÁL MÉRÉSE ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁVAL
sejtaktiváció
idő
alapjel
INTRACELLULÁRIS CITOKINTERMELÉS
KIMUTATÁSA IMMUNFLUORIMETRIÁVAL
jelölt citokinspecifikus
ellenanyagok
 a sejtmembránt detergenssel
átjárhatóvá lehet tenni
 de előtte a sejteket fixálni kell,
hogy ne essenek szét a
detergenstől (pl. aldehides fixáció)
cytokines
 előzőleg a sejtek valamilyen, a
sejttípusra jellemző antigént
felismerő ellenanyaggal is
megjelölhetők („sejttípus marker”,
pl. CD4)
GÉNAKTIVÁCIÓ VIZSGÁLATA
A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS
segítségével is kimutatható
Pl. citokin gének aktivációja
KVANTITATÍV (REAL-TIME) PCR (qPCR/qRT-PCR)
 sejtek  RNS izolálás
 RNS  reverz transzkripció (RT-PCR)  cDNS
 cDNS  polimeráz láncreakció (PCR) mennyiségi
meghatározás
(a génaktiváció fehérje szinten történő vizsgálata WB)
minél több mRNS-t tartalmazott a minta,
annál hamarabb (kevesebb ciklus alatt)
éri el az amplifikáció a küszöböt
ELISPOT
Enzyme Linked Immuno-Spot
 elve hasonló az ELISA-hoz
 Ig-okat, citokineket, kemokineket, granzimet és más oldott
effektor molekulákat termelő sejtek számának meghatározása
 érzékeny módszer: 1 aktivált sejt kimutatása 300 000 közül.
(Nemcsak poliklonális, de antigén specifikus aktivációt követően
is kimutatja az aktivált sejteket.)
ELISPOT
Enzyme Linked Immuno-Spot
- Antigén specifikus „capture” ellenanyagok
kitapasztása
- Blokkolás
- Sejtek hozzáadása (aktiváció, inkubáció)
- Mosás
- Biotinnal konjugált antigén specifikus
másodlagos ellenanyag hozzáadása
- Avidin-enzim konjugátum
- Oldhatatlan kromogén szubsztrát
hozzáadása (AEC 3-amino-9-ethylcarbazol)
Citokintermelő sejt
helyét jelölő folt
Az ELISPOT lemez egy lyukának
felülnézete a képződött foltokkal
ELISPOT
Enzyme Linked Immuno-Spot
Leolvasás mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy „ELISPOT plate reader”
segítségével (gyors, standardizálható - spotok számának és méretének meghatározása)
ÉLETKÉPESSÉG VIZSGÁLAT
MTT (Dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium só)
Életképesség kolorimetriás mérése (apoptótikus
sejtek). NADPH-függő celluláris oxireduktáz
enzimek az MTT festéket oldhatatlan lila színű
formazánná redukálják.
PI (propidium-jodid)
Egy fluoreszcens molekula, amely képes a nukleinsavba beépülni. Áramlási
citometriával vizsgálható az életképesség. Élő sejtekbe nem képes behatolni.
7-AAD (7-aminoactinomycin D)
Egy fluoreszcens molekula, amely duplaszálú DNS-be interkalálódik. Élő sejtek
membránján nem képes átjutni, vagyis használható életképesség mérésre
áramlási citometriával.
SEJTOSZTÓDÁS VIZSGÁLATOK
timidin beépülés- a növekvő DNS tartalmat méri (β-bomlás
mérése). Nem detektálja, hogy hány sejt hányszor osztódott.
3H-jelölt
Bromodeoxyuridin (BrdU) - timidin-analóg, adható kísérleti állatokba
vagy sejtkultúrákhoz. Az osztódó sejtek BrdU specifikus
ellenanyagok felhasználásával kimutathatók (mikroszkópia, FACS).
CFSE (Karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter)
Fluoreszcens festék, amely könnyen bejut a sejtekbe és
intracelluláris amin struktúrákhoz kötődik. Tanulmányozható a
sejtosztódás, migráció, elhelyezkedés.
CFSE
SEJTOSZTÓDÁS NYOMON KÖVETÉSE
 „Cell tracer” festékek bekerülnek a sejtekbe és
csapdába esnek
 Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az
intracelluláris fehérjékhez
 In vitro és in vivo nyomon követhető a limfociták
osztódása
Fokozatosan a felére csökken a fluoreszcencia
intenzitás az utódsejtekben
CFSE-vel jelölt nem
osztódó, nem aktivált
sejtek fluoreszcens
intenzitása