Transcript 8. szeminárium - ELISA, immunoblot, immunhisztokémia

ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG
KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ
PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK
Immunaffinitás kromatográfia
ELISA – Enzim kötött immunszorbens esszé
ELISA plate különböző
koncentrációjú mintákkal a
szubsztrát hozzáadását követően
ELISA plate különböző
koncentrációjú mintákkal az
enzimreakció leállítását követően
AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE
ELLENANYAG TISZTÍTÁS ANTIGÉN IMMUNSZORBENSEN
oszlop
polimer gyöngyök
oszlop
töltelék
„affinity purified antibody” : a katalógusokból
rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel
tisztítják
rákötött antigének
A TISZTÍTÁS LÉPÉSEI
1)
2)
3)
4)
Tisztítandó
ellenanyagok
hozzáadása
Kötődés
Mosás
Elúció
ANTIGÉNTISZTÍTÁS
1) Tisztítandó oldat felvitele
oszlop
2) Kötődés
3) Mosás
oszlop töltelék
polimer gyöngy
4) Elúció
hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok
Tisztított antigén
IMMUNPRECIPITÁCIÓ
• egy adott fehérje
izolálása és
koncentrálása sok
fehérjét tartalmazó
mintákból
• fehérje
kölcsönhatások
vizsgálata (pl.
jelátvitelben
résztvevő
molekulák
vizsgálata)
ELISA
Enzyme Linked Immune Sorbent Assay
ELISA plate (lemez)
lyuk avagy kút
Különböző lemezek – különböző természetű molekulákhoz
enzyme linked
immune sorbent
enzim
ellenanyaghoz konjugált enzim
felülethez, vagy
ellenanyagokhoz kötődő
antigének/ellenanyagok
AZ ELISA VIZSGÁLATBAN AZ MENNYISÉGÉVEL
ARÁNYOS MÉRTÉKŰ VÁLTOZÁST DETEKTÁLUNK
Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció
mértékéből következtethetünk
Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigénellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA
SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI
Indirekt módszer
Direkt módszer
Jelzés
Jelzés
Szekunder
ellenanyagok
Primer
ellenanyag
Antigén
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA
SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI
Enzim-antienzim rendszer
PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz
APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz
Enzimek
A primer ellenanyaggal azonos
(izo)típusú enzim-specifikus
ellenanyag
Primer ellenanyag
Antigén
Szekunder
ellenanyag
(faj v. izotípus
specifikus)
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA
SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI
Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek
Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni
Egyszerű
Avidin-enzim komplexek
ABC
Avidin Biotin
Complex
Jel felerősítése
Biotin-enzim komplex
Avidin
Biotinált ellenanyag
Antigén
KOMBINÁLT „SZENDVICS” ELISA
Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok,
nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor).
citokin specifikus ”capture”
ellenanyagok kitapasztása
telítés: a szabad plasztikfelület
beborítása aspecifikus fehérjével
citokin tartalmú minta
hozzáadása
eltérő antigén determinánst
felismerő biotinilált ellenanyagok
hozzáadása
avidinnel konjugált enzim
hozzáadása
színreakcióhoz szükséges anyagok
hozzáadása
nem kötődő anyagok kimosása
felesleges fehérjék kimosása
felesleges ellenanyagok kimosása
felesleges konjugátum kimosása
EGYSZERŰ INDIREKT ELISA LÉPÉSEI
Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához
Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok
kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével
felesleges antigén kimosása
az antigén kitapasztása
(coating avagy fedés)
felesleges fehérjék kimosása
felesleges ellenanyagok kimosása
telítés: a szabad
plasztikfelület beborítása
aspecifikus fehérjével
specifikus ellenanyagok
hozzáadása
enzimmel konjugált szekunder
ellenanyagok hozzáadása
színreakcióhoz szükséges anyagok
hozzáadása
HIV burokfehérje, vagy nagy méretű
szintetikus peptid
KOMPETITÍV ELISA
Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A
mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így
gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított
antigénhez.
- A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás
- Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó
- Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés
- Mosás
- Kromogén anyagok hozzáadása
vagy nem tartalmazó minta hozzáadása
A standard hígítási sora
OD
Ismeretlen koncentrációjú minta
Az összehasonlíthatósághoz az
ismeretlen mintából is hígításokat
kell csinálni!
Ez az a tartomány, ami a
koncentrációt jellemző
értékeket ad
Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne
koncentráció
Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.
0.004
0.007
0.015
0.030
0.061
0.12
0.24
0.49
0.97
1.9
3.9
7.8
16
31
62
125
250
500
1000
?
0
BIOAKTÍV ANYAGOK KIMUTATÁSA
hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek
Tumor antigének kimutatása
Citokinek, hormonok kimutatása
doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása
szendvics technikával vagy kompetitív tesztekkel
TUMORDIAGNOSZTIKA
A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő
ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában
Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak
Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag
(a kit része)
Tumor antigén (pl. a beteg szérumából)
Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal
(a kit része) fedett felület
Prosztata daganatok
prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus
prosztata hiperpláziás (BPH) és prosztatitiszes páciensekben  nem specifikus, de a PSA szérum
szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával (monitorozásra alkalmas)
hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a
szérumból
AZ ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG
KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS
ANALITIKAI MÓDSZEREK
immunoblot (Western blot)
immunhisztokémia
WESTERN BLOT
Anode(+)
Lépések:
1) minta előkészítés (szöveti vagy
sejtes)
2) gél elektroforézis
3) blotolás
4) jelölés
5) előhívás
Cathode(-)
Felhasználás: fehérje keverékek egyes
komponenseinek ellenanyag segítségével
történő kimutatására
WESTERN BLOT
• Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben
ellenanyagokat használnak
• SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján
(átfedés is lehetséges)
• Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus
ellenanyaggal történik
Standard
Fehérje detektálás specifikus ellenanyagepitóp kölcsönhatás alapján
Protein
minta
SDS-PAGE
Membrán
Western blot
WESTERN BLOT
•
Segítségével egy adott fehérje jelenléte
kimutatható a mintában
•
Az egymástól elektroforézissel elszeparált
fehérjéket /Nátrium-Dodecyl SzulfátPolyacrylamid Gélelektroforézis (SDSPAGE)/, membránra transzferálják
•
Primer ellenanyagot (monoklonális vagy
poliklonális) használnak a vizsgált fehérje
kimutatásához
•
Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált
szekunder ellenanyag segítségével mutatják
ki a primer ellenanyag kötődését
WESTERN BLOT
Kimutatási eljárások:
Kolorimetriás (peroxidáz enzim – denzitometria /
spektrofotometria)
Kemilumineszcens (ECL)
Radioaktív (izotóp – RTG)
Fluoreszcens (jelölés – CCD camera)
MEGNÖVELT KEMILUMINESZCENCIA
/Enhanced chemiluminescence (ECL)/
• H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a
diacilhidrazidokat (pl luminol)
• Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy
fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba
• A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával
detektálható
• A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák
(pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére
növelhető (enhancer)
Immobilizált
proteinek
Fab
Primer
ellenanyag
Fc
Epitóp a
protein
felszínén
Membrán
Tormaperoxidáz
Szekunder
ellenanyag
H2O2
luminol
H2O
luminol
h
enhancer
detektálás
IMMUNCITOKÉMIA / IMMUNHISZTOKÉMIA
Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az
antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban
• Immunfluoreszcencia
• fluoreszcensen jelzett ellenanyag
FITC – fluoreszcein izotiocianát (zöldessárga)
PE – fikoeritrin (narancssárga)
• Immunoenzim módszer
• enzimmel konjugált ellenanyag
P – peroxidáz
AP – alkalikus foszfatáz
(a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek)
IMMUNHISZTOKÉMIA
FIXÁLÁS
METSZÉS
Szövetminta
FAGYASZTÁS
Festés előtti metszet
IMMUNHISZTOKÉMIA
Enzim
Biotin
Avidin
Szekunder antitest
ABC komplex:
• biotinált ellenanyag
• avidin
• biotinált enzim
Primer antitest
Tárgylemez
Sejtek (sejttenyészetek)
Szövetmetszet
Hagyományos hisztokémia
Akut bronchopneumonia (hematoxilin-eozin festés)
Viszonylag kevés sejttípus azonosítható
Immunhisztokémia
(CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)
Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)
Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC)
Lehetőség van részletes morfológiai információk kinyerésére (lásd a további ábrákat is)
Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt
Mitokondrium F-aktin Sejtmag
Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejt
Peroxiszóma Mitokondrium Sejtmag