Transcript letöltés - Regionális Immunológiai Laboratórium

Az autoimmun kórképek
laboratóriumi diagnosztikája I.
Szisztémás autoimmun betegségek
Az autoimmun betegségekről általában
• Az immunrendszer saját antigénekkel szembeni toleranciája felborul, és
a saját sejtekkel, szövetekkel szembeni (humorális és celluláris)
immunreakció lép fel
• Megkülönböztetünk szisztémás (több szervet, vagy a szervezet egészét
érintő), és szervspecifikus autoimmun betegségeket
• A szisztémás autoimmun betegségek diagnosztizálása nemzetközi
konszenzuson alapuló kritériumrendszerek alapján történik
• A diagnosztikai kritériumok között laboratóriumi eltérések is vannak,
mint pl. az adott kórképre jellemző autoantitest jelenléte
• Az autoantitest-kimutatás mellett a szisztémás autoimmun betegségek
laboratóriumi diagnosztikájának és követésének egyéb módszerei:
- Komplement-vizsgálatok (komplement-faktor szintek, komplement
aktivitás)
- Immunglobulin szint mérés
- CRP, egyéb akut fázis proteinek
- Hematológiai vizsgálatok, vérkép
- Hemosztázis vizsgálatok (lupus anticoagulans)
- Krioglobulin kimutatás és analízis
stb.
Autoantitestek
Fiziológiás autoantitestek
Pathológiás autoantitestek
- alacsony titer
- alacsony affinitás
- IgM izotípus
- polireaktivitás
- fontos, konzervatív szerkezetű
molekulák ellen irányulnak
- magas titer
- magas affinitás
- IgG izotípus
- magas specificitás
Szisztémás kórképek:
Szervspecifikus kórképek:
Általános sejt(mag)komponensek
elleni autoantitestek
szerv- és szövetspecifikus antigének
elleni autoantitestek
Pathogén antitestek
Nem pathogén antitestek
- antifoszfolipid, ANCA
anti-GBM, stb
- anti-Sm, anti-Jo-1, stb
Kimutatásuk:
ELISA vagy indirekt immunfluoreszcens (IIF) technikával
(egyéb módszerek: blot, RIA, FIA, agglutinációs, precipitációs
technikák)
A legfontosabb szisztémás autoimmun betegségek
•
•
•
•
Szisztémás lupus erythematosus (SLE)
Rheumatoid arthritis (RA)
Sjögren szindróma (SS)
Kevert kötőszöveti betegség (mixed connective tissue disease,
MCTD)
• Szisztémás sclerosis (SSc), scleroderma
• Polymyositis/Dermatomyositis (PM/DM)
• Primer vasculitisek
• Antifoszfolipid szindróma
A poliszisztémás autoimmun kórképek legfontosabb autoantitestjei:
1.
Antinukleáris faktor (ANF) vagy „antinuclear antibody” (ANA): a sejtmag különböző
komponensei ellen irányuló autoantitestek összefoglaló neve. Indirekt
immunfluoreszcenciás szűrővizsgálat.
2.
Kettősszálú DNS (dsDNS) elleni antitest: az SLE egyik diagnosztikus kritériuma
(homogén ANF magfluoreszcencia)
3.
Hiszton elleni ellenanyag: gyógyszer indukálta SLE ellenanyaga (homogén ANF
magfluoreszcencia)
4.
Kromatin (nukleoszóma) elleni antitest: dszDNS + hiszton komplex ellen képződött
ellenanyagok, jellemzőek lupus nephritisre
5.
Extrahálható nukleáris antigének (ENA) elleni antitestek, szemcsézett (granuláris) ANF
magfluoreszcenciát mutatnak. Antigén komponenseik: SS-A (Ro), SS-B (La), Sm, U1RNP,
Scl-70, Jo-1 nevű RNS-ből és nem hiszton természetű fehérjéből álló komplexek.
Anti-neutrofil citoplazmatikus antitestek (ANCA) típusai:
Citoplazma fluoreszcenciát mutató c-ANCA,
perinukleáris fluoreszcenciát mutató p-ANCA és
atípusos mag és citoplazmafluoreszcenciát mutató atípusos ANCA.
Antifoszfolipid antitestek típusai:
anti-kardiolipin antitest
anti- béta2glikoprotein1 antitest
lupus antikoaguláns
6.
7.
Az autoantitestek kimutatásának
jelentősége
• Diagnózis felállítása - marker autoantitestek
(SLE:anti-dsDNS, anti-Sm; pSS: anti-SSA, SSB;
MCTD: anti-U1RNP stb.)
• Differenciáldiagnózis
• Alcsoportba sorolás, prognózis előrejelzése
(SSc: anti-centromer, anti-Scl70)
• Aktivitás megítélése, terápia nyomonkövetése
(anti-dsDNS, anti-Jo1, ANCA)
ANA kimutatás
• Szűrőtesztek
– Indirekt immunfluoreszcencia
patkányszövet (máj, vese, gyomor)
HEp-2 sejt
– ELISA screen (HeLa, HEp-2 mag- vagy
sejtkivonat, tisztított és/vagy humán
rekombináns antigének)
Antinukleáris antitest (ANF, ANA)
• Gyűjtőfogalom: A sejtmag különböző komponensei ellen irányuló autoantitestek
összefoglaló neve
• Kimutatásának standard módja:
• Kimutatásához használt szubsztrát:
indirekt immunfluoreszcencia (IIF)
- szervmetszet (rágcsáló máj, vese)
- HEp-2 sejtek
Rágcsáló szervmetszet
- nem humán antigén
- a metszés következtében a
sejtmagok roncsolódhatnak
- kisebb sejtmagok
- osztódó sejtek nincsenek
- kevesebb mintázat azonosítható
HEp-2 sejtek (human epithelioma sejtvonal)
- humán antigén
- ép sejtmagok, monolayerben
- nagy sejtmagok
- nagyszámú osztódó sejt
- több mintázat azonosítható
Antinukleáris antitest
májmetszeten:
HEp-2 sejteken:
Antinukleáris antitest (ANF, ANA) kimutatás IIF technikával
• ANF kimutatás IIF technikával: szűrőmódszer,
amely
- az antitest specificitásának megállapítására csak egyes
esetekben,
- az antitest mennyiségének megállapítására csak a vizsgált
szérum titrálása esetén alkalmas
• Ezért: ANF pozitivitás esetén további vizsgálatok szükségesek az antitest
specificitásának megállapítására, és mennyiségi meghatározására
Autoantitest kimutatás indirekt immunfluoreszcens technikával
Szubsztrát: sejt, szervmetszet
tágylemezen
Antigén-antitest komplex
Ag-At. +2.antitest-FITC
A HEp-2 sejt sematikus felépítése
Leggyakoribb ANF mintázatok HEp-2 sejten
•
•
•
•
•
Homogén
Granuláris (finom / durva) (speckled)
Nukleoláris
Magmembrán*
Centromer*
• Citoplazmatikus mintázatok: mitokondrium*
Golgi készülék*
citoszkeleton
riboszóma
mitotic spindle (oszlási orsó)*
* Mintázat alapján azonosítható autoantitestek
Anti dsDNA antitest
HEp-2 sejt
SLE: Anti-dsDNS: 60-70 %, anti-hiszton: 40-60%. Anti-nukleoszóma:85-90%.
Anti-SS-A/Ro antitest
pSS: anti-SSA:85-90 %, SLE:40-50%.
Anti-SS-B/La antitest
pSs:anti-SSB: 70-75%, SLE: 20-25%.
Anti-Sm antitest
SLE: 30-35%.
Anti-U1RNP antitest
MCTD: >95%
Anti-Jo1 antitest
PM/DM: 20-25%.
Anti-Scl-70 antitest
PSS: 40-50%.
Anti centromer antitest
PSS: 40-50 %.
Mitokondrium elleni antitest
Az indirekt immunfluoreszcens technika
problémái
A szubsztrát preparálása
friss preparátum, +4°C-on 1 évig, -70°C-on néhány évig
eltartható
A detektáló antitest
bárány, kecske vagy nyúl használható az immunizáláshoz
A-P (affinity-purified) antitest a kívánatos
A vizsgálandó minta higítása
1:5, 1:10, 1:20 – tovafutó hígítás
A konjugátum/minta hígítása: PBS+Tween 20 vagy BSA/PBS
Az indirekt immunfluoreszcens technika az esetek többségében az
autoantitestek kimutatásának szűrőmódszereként
alkalmazható, a további identifikálás ELISA technikát igényel!
IIF ANA vizsgálatok standardizálásának problémái
•
•
•
•
Szubsztrátok különbözősége
Szubsztrát fixálásának különbözősége
Különböző szérumhígítások
Konjugátumok (fluorokrómmal konjugált anti-human immunglobulin)
különbözősége
(faj, izotípus, fluorescein/protein arány)
• Fluoreszcens mikroszkópok különbözősége (érzékenység)
• Nem specifikus antitestek zavaró hatása
• Emberi tényező
• Referencia preparátumok:
- Arthritis Foundation/CDC (USA) ANA Reference Sera (1-10)
- WHO: W1064 anti-nuclear-factor (homogeneous) 66/233
Arthritis Foundation/CDC ANA Reference Sera
Mintázat
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Homogén
Granuláris (speckled)
Granuláris (speckled)
Granuláris (speckled)
Granuláris (speckled)
Nukleoláris
Granuláris (speckled)
Centromere
Homogén
?
Antitest specificitás
ds-DNA
SS-B
SS-A, SS-B, RNP
RNP
Sm
N/A
SS-A
N/A
Scl-70
Jo-1
Az indirekt immunfluoreszcens technika
problémái I
Szubsztrát, detektáló antitest kiválasztása
• Rágcsáló szövetmetszetek (patkány, egér)
Az antigén nem humán, a kötődés gyenge
Heterofil antitestek magas hátteret adnak
Az indirekt immunfluoreszcens
technika problémái II
Humán szövetmetszetek
A beszerzés problematikus
A detektáló antitest a humán szövethez kötődve magas hátteret
ad
Az indirekt immunfluoreszcens
technika problémái III
Majom szövetmetszetek I
A humán és majom immunglobolinok 98%-os azonossága
A detektáló antitest a majomszövethez kötődik, magas hátteret
ad
Az indirekt immunfluoreszcens
technika problémái IV
Majom szövetmetszetek II
A detektáló antitest species specifikus, ezért csak a humán
antitesthez kötődik
ANA kimutatás ELISA-val
Antigén:
- sejtmagkivonat
- tisztított (állati eredetű) antigének elegye
- rekombináns (humán) antigének elegye
IIF ANAELISA
ELISA
ELISA
(sejmagkivonat) (tisztított ag)
(rekombináns ag)
Anti-dsDNA
+ (hom.)
+
Anti-Sm
+ (gran.)
+
Anti-fibrillarin + (nukleoláris) +
Anti-mitokondr.+ (citoplazmatikus) -
+
+
-
+
+
-
Az ANA ELISA tesztek nem standardizáltak!
A klinikusnak tisztában kell lennie azzal, hogy a laboratórium milyen
módszert alkalmaz ANA kimutatásra!
Autoantitest kimutatás ELISA-val
•
•
•
•
1.
2.
3.
4.
Antigén
Antigén – antitest komplex
Antigén – antitest komplex + konjugátum (2.antitest)
Antigén – antitest komplex + konjugátum + szubsztrát =színes termék
A színreakció intenzitása arányos a mintában levő autoantitest mennyiségével
ELISA vizsgálat több pontos kalibrációval
A legfontosabb antinukleáris antitestek szisztémás autoimmun
betegségekben
SLE
MCTD
RA
Sjögren
PM/DM
SSc
dsDNA
60-80%
-
+-
-
+-
+-
nukleoszóma
80-90%
30-40%
-
-
-
30-40%
Hiszton
30-50%
-
-
-
+-
+-
Sm (Smith)
10-20%
-
-
-
-
-
(U1)RNP
30-40%
100%
-
+-
-
+-
SS-A
40-50%
-
+-
80-90%
+-
+-
SS-B
centromer
20-25%
-
-
70-75%
-
-
-
-
-
-
-
20-30%
Scl-70
-
-
-
-
-
20-30%
Jo-1
-
-
-
-
20-30%
-
Egyéb antinukleáris (és egyéb, nem sejtmag ellen irányuló) antitestek
is előfordulnak szisztémás autoimmun betegségekben!
Autoantitest ELISA-k antinukleáris antitestek azonosítására
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Anti-dsDNA
Anti-nukleoszóma
Anti-hiszton
Anti-SS-A
Anti-SS-B
Anti-Sm
Anti-ENA
Anti-Sm/RNP
Anti-Scl-70
Anti-Jo-1
• ELISA vizsgálat
jellegzetességei:
- specifikus
- mennyiségi meghatározást
tesz lehetővé
- automatizálható
Autoantitest ELISA-k standardizálásának problémái
•
•
•
•
Szilárd fázis (plate-ek) különbözősége
Antigének különbözősége (tisztított, vagy rekombináns)
Antigének koncentrációjának különbözősége
Konjugátumok (második ellenanyagok) különbözősége, jelölés
módja (HRPO, alkalikus foszfatáz)
• Szubsztrátok különbözősége
• Mértékegységek és referencia-tartományok különbözősége
• Referencia preparátumok
WHO International Standard preparation
- W1065 anti-dsDNA (Wo/80)
WHO reference reagent
- W 1063 anti-nuclear ribonucleoprotein (nRNP) autoantibody
ANA vizsgálat ajánlott algoritmusa ANA ELISA
alkalmazása esetén
ANA ELISA (antigén: sejtmagkivonat)
Negatív
Pozitív
IIF ANA
Antigén-specifikus
ELISA-k
• Autoantitestek, melyeknél a
mennyiségi meghatározás
klinikai információt hordoz
(aktivitási markerek)
Anti-dsDNA
Anti-nukleoszóma/kromatin
ANCA
• Autoantitestek, melyeknél a
mennyiségi meghatározás nem
informatív
Anti-Sm
Anti-Sm/RNP (U1RNP)
Anti-SS-A, anti-SS-B
Anti-centromer
Anti-Scl-70
Köszönöm a figyelmüket!