Transcript letöltés - Regionális Immunológiai Laboratórium

Az immundeficienciák
kimutatásának
laboratóriumi módszerei
Nagy Gábor
DEOEC III. Belgyógyászati Klinika
Regionális Immunológiai Laboratórium
ODLA III. évfolyam
Immunológiai diagnosztikai módszerek
2010. március 16.
Diagnosztikai algoritmus
Kezdeti vizsgálatok
fizikális vizsgálat, anamnézis
családi anamnézis
vérkép, össz Ig osztályok
mikrobiológia, mellkas röntgen
szekunder immundef. kizárása
Humorális immunr.
szűrő jellegű vizsg.
Speciális vizsgálatok
Sejtes immunr.
szűrő jellegű vizsg.
Speciális vizsgálatok
Genetikai vizsgálatok
Fagocitasejt
szűrő jellegű vizsg.
Speciális vizsgálatok
Genetikai vizsgálatok
Komplement
rendszer
szűrő jellegű vizsg.
Speciális vizsgálatok
Genetikai vizsgálatok
Genetikai vizsgálatok
Első vizsgálatok:
vérkép

metodika:
– optikai elv
– impedancia elv

paraméterek:
– össz fehérvérsejt szám
– absz. limfocita szám
– absz. granulocita szám
– thrombocita szám és méret (MPV)
Első vizsgálatok:
össz IgG, IgA, IgM
Turbidimetria
Nefelometria
A fényszórással arányos
fényintenzitás csökkenését méri
A szórt fény
intenzitását méri
Immunglobulinok
mennyisége
Immunglobulin szintek
életkor függése
IgG
IgA
Ig
M
Immunglobulin szintek:
össz IgE




Több nagyságrenddel alacsonyabb
koncentráció
ELISA (indirekt jelölésű)
kU/l
hiper IgE-sy
Össz Ig szintek változása
immundeficienciákban


hipogammaglobulinémia esetén ki kell zárni
a veszést (pl. nephrosis sy)
Szelektív IgA hiány:
– se és nyál IgA mérhetetlenül alacsony





Hiper IgM: IgM, IgA, IgG
Hiper IgE: IgE  (>2000 kU/l)
congenitális agammaglobulinémia: IgG, A,
M
CVID: Ig  (>=két Ig osztályban)
ALPS: Ig 
Szűrő jellegű vizsgálatok
Immunológiai szűrőtesztek immundefektus gyanúja esetén
Feltételezett
immundefektus
Immunológiai teszt
Humorális
Szérum -IgM, -IgG, -IgA és alosztály vizsgálatok
Izohemagglutinin-titer
Fehérje antigénre adott immunválasz (Diphtheria
toxin e.antitest, Tetanus toxin e.antitest)
Poliszacharid antigénre adott immunválasz
(H.influenzae e.antitest, Pneumococcus
e.antitestek)
Sejtes
Abszolút limfocitaszám
Tuberkulin-bőrteszt
Tetanus-bőrteszt
Diphteria-bőrteszt
Candida-bőrteszt
Fagocitasejt-defektus
Abszolút granulocitaszám
NBT teszt
Szérum IgE
Komplementdefektus
Összkomplement-aktivitás mérése hemolitikus
módszerrel (klasszikus és alternatív út)
Humorális immunrendszer:
IgG alosztályok





G1, G2, G3, G4 alosztályok
metodika: nefelometria
az össz IgG ált normális tartományban
van (kivéve, ha IgG1 hiányzik)
izolált alosztály deficiencia
szelektív IgA hiány mellett gyakran
Izohemagglutinin




az A és B vércsoport ellenes, alacsony
affinitású IgM típusú At-ek, melyek a
vércsoport-szabálynak megfelelően
fiziológiásan megjelennek, valószínűleg
bakteriális Ag-ek keresztrekaciója miatt
hiányuk B-sejt defektusra utal
módszer: hemagglutináció
hiányzik: pl. CVID
Fehérje és poliszacharid
specifikus antitestek



Fehérje antigénre adott immunválasz
– Diphtheria toxin e. antitest
– Tetanus toxin e. antitest
Poliszacharid antigénre adott immunválasz
– H. influenzae e. antitest
– Pneumococcus e. antitestek
– Meningococcus e. antitestek
módszer: ELISA
Fehérje és PS specifikus antitestek
csökkent válasz: CVID
Sejtes immunrendszer vizsgálatai:
Absz. limfocita szám

Absz. limfocita szám
– életkorfüggő referencia tartomány
– elsősorban a T-sejtszámot tükrözi
– limfopénia:
SCID (gamma-lánc, ADA, PNP, reticuláris
dysgenesis)
 cong. agammaglobulinémia

– csökken lehet: CVID
Bőrtesztek





T-sejt funkció jó szűrőtesztje
vírus és gomba fertőzések
antigén:
–
–
–
–
Tuberkulin-bőrteszt
Tetanus-bőrteszt
Diphteria-bőrteszt
Candida-bőrteszt
elve: késői típusú hiperszenz.
in vitro: limfocita proliferációs tesztek
Áramlási citometria
Áramlási citometria









T limfocita markerek:
B limfocita markerek:
Helper T limfocita marker:
Citotoxikus T limfocita marker:
NK sejt markerek:
T sejt aktivációs markerek:
Neutrofil granulocita markerek:
Monocita markerek:
Makrofág markerek:
CD3, CD2, CD7
CD19, CD20, CD21
CD4
CD8
CD56, CD16
CD69, CD25, HLA-DR
CD16, CD32
CD13, CD14
CD36, CD68, CD71
Áramlási citometria

limfocita
szubpopuláció:
– T: CD3+


Th: CD4+
Tc: CD8+
– B: CD19+
– NK: CD16+, CD56+
Áramlási citometria
Betegség
B
T
NK
Bruton-kór
-
+
+
CVID
+/-
+
+
gamma-lánc def
+
-
-
ADA
-
-
-
PNP
+
-
-
RAG1/2 def.
-
-
+
MHC-I def.
+
+(CD8)
+
MHC-II def.
+
+(CD4)
+
DiGeorge-sy
+
+/-
+
Áramlási citometria




CD40, CD40L, sIgA/G/D (hiperIgM)
MHC I-II (MHC deficienciák)
CD4-/CD8- T-sejt : ALPS
Treg  (CD4+,CD25bright,FOXP3+):
– Immunodysregulation,
polyendocrinopathy, enteropathy X-linked
(IPEX)
ADA, PNP enzimaktivitás

purin anyagcsere enzimei
– Adenozin dezamináz:

adenozin-inozin átalakítás
– Purin nukleozid foszforiláz:



guanozin-guanin
inozin-hipoxantin átalakítás
Súlyos kombinált ID
– ADA: T és B
– PNP: elsősorban T (valószínűleg a T sejtek
magas dGTP tartalma miatt)
ADA, PNP enzimaktivitás





eritrociták enzimaktivitását határozzuk meg
vvt-ket 3x mossuk
beállítjuk a hgb-t
lizáljuk a vvt-ket
megfelelő szubszrátot adunk a rendszerhez
– adenozin (ADA)
– inozin (PNP)


a keletkező végterméket UV spektrofotometriával
mérjük
az enzimaktivitást hgb-ra normálva adjuk meg
ADA, PNP enzimaktivitás

az enzimaktivitás:
– homozigóta formában mérhetetlenül
alacsony
– heterozigóta formában kb. az kontrollok
fele

parciális ADA deficiencia:
– vvt-ben nem mérhető aktivitás, de más
szövetekben van (instabil enzim)
Fagocita rendszer vizsgálatai:
abszolút neutrofil szám





Kostmann sy
ciklikus neutropénia
Chediak-Higashi sy
reticularis dysgenesis
WHIM sy (Wart,
Hypogammaglobulinem
ia, Infection, and
Myelokathexis
syndrome)


kemoth.
gyógyszerek
– immun
– nonimmun




autoimmun
alloimmun
hiányállapotok (B2,
folsav, réz)
AIDS
Fagocita sejtek vizsgálata:
granulocita ellenes at.

a mérés elve lehet:
– áramlási citometria
– sejtes ELISA
Fagocita sejtek vizsgálata:
funkcionális vizsgálatok

adherencia
– granulocita szám mérés
– üveggyönggyel inkubáció
– granulocita szám mérés

adhezív proteinek (áramlási citometria):
– LAD1: CD11a,b,c/CD18
– LAD2: CD15

kemotaxis
– Boyden-kamra
Fagocita sejtek vizsgálata:
funkcionális vizsgálatok

fagocitózis
– mikroszkóp: particulumok (élesztőgomba)
– FC: FITC-cel jelölt immunglobulinnal
preopszonizált E. coli
– telepszámlálás: be nem kebelezett
baktérium visszamérése

intracelluláris killing
– telepszámlálás: bekebelezés után életben
maradt baktériumok visszamérése
Fagocita sejtek vizsgálata:
funkcionális vizsgálatok

oxidatív burst
– NBT (nitroblue-tetrasolium) redukció


sárga NBT->kék/fekete formazán
mikroszkópos kiértékelés
– DHR (dihidro-rodamin) oxidáció

DHR->rodamin (fluoreszkál)
– teljes vér kemilumineszcencia

H2O2 + luminol -> 3-aminoftalát* -> 3-aminoftalát + foton
– szuperoxid anion termelés
 ferricitokróm-C szuperoxid-dizmutázzal gátolható
redukciója (fotometriás kiértékelés)

csökkent: CGD
Fagocita sejtek vizsgálata:
enzimdefektusok

MPO
– primer, azurofil granulumban található
enzim
– H2O2->HOCl
– deficienciája gyakori: 1:2000
– benzidin-hidrokloridot oxidálja->kék szín
Fagocita sejtek vizsgálata:
mikroszkópos morfológia


ChediakHigashi sy
kóros a
fagolizoszóma
formálás
Komplement rendszer:
deficienciák
Komplement rendszer:
össz komplement aktivitás

klasszikus út: CH50
– szenzitizált birka vvt.

alternatív út: AH50
– nyúl vvt.
Komplement rendszer:
CH50 meghatározás
50x 100x 200x 400x
Vak
Spontán lísis kontroll
Teljes lízis kontroll
Beteg1
Beteg2
Betegx
hemolízis%=
(ODminta-OD(SPLK))/OD(TLK)
Komplement rendszer:
CH50 meghatározás
CH50=annak a szérumtérfogatnak a
reciproka, ami 50%-os lízist okoz
logx=logK+1/n*log(y/(1-y))
x=szérum térfogat
y=hemolízis%
Komplement rendszer:
értékelés
CP
AP
C3
C4
Magyarázat
0
N
N
N
C1q, C1r, C1s,
C2 deficiencia
0
0

N
C3 def.
0
N
N

C4 def.
0
0
N
N
C5-C9 def

N
N

HANO

N


CP
comsumptio
Komplement rendszer:
egyes faktorok

antigén meghatározás:
–
–
–
–

radiális immundiffúzió
rakétaelektroforézis
nefelometria
ELISA
funkciónális meghatározás:
– hemolitikus assay (a mérendő faktor kivételével
a faktorok feleslegben)
– klasszikus út komponensei: szenzitizált birka vvt.
– alternatív út komponensei: nyúl v. tengerimalac
vvt.