Transcript 2011. november 4. - Varga Gábor előadás

Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit
transzportfolyamatok vizsgálatára
HEGYESI Orsolya1, FÖLDES Anna1,BORI Erzsébet1, LŐRINCZ Ádám2, RÁSONYI-KOVÁCS Orsolya2 ,
BARABÁS József2, Martin C. STEWARD3, VARGA Gábor1
1 Orálbiológiai
Tanszék, 2 Arc- állcsont- Szájsebészeti és Fogászati Klinika; Semmelweis Egyetem, Budapest; 3Faculty of Life
Sciences, The University of Manchester, UK
Háttér
Sjögren szindróma
sugárterápia
(fej-nyaki tumorok kezelésére)
csökkent nyáltermelés
acinus sejtek pusztulása
hiposzaliváció
Primer sejtkultúrák létrehozásának kidolgozott lehetőségei
huSMG – primary human salivary cell culture (primer humán nyálmirigy sejtkultúra) Tran et al. Tissue Eng 2005 11:172
PTHSG – primary total human salivary gland (primer teljes humán nyálmirigy sejtkultúra) Szlavik et al. Tissue Eng 2008
14:1915-26
Célkitűzés
humán szubmandibuláris nyálmirigyből primer sejtkultúra létrehozása, PTHSG és
huSMG tulajdonágainak összehasonlítása
optimális kondíciók meghatározása polarizált epitheliális monolayer
létrehozásához
transzepitheliális ionáramok vizsgálata
az elektrolit transzportban résztvevő transzporterek meghatározása
Módszerek és eredmények
Sejttenyésztés – primer kultúra
gyorsan letapadó sejtek: PTHSG
„mesenchimális progenitorok”
egy nap utáni felülúszó: huSMG
„epitheliális progenitorok”
Transzpithelialis rezisztencia mérése
TEER (Ωcm2)
1200
Hepato-STIM
800
10x
PTHSG
MEM
10x
huSMG
Hepato-STIM
10x
MEM 2 nap
400
0
PTHSG
Hepato-STIM
MEM 1. nap
MEM 0 nap
0
2
4
6
8
days
Kulcstranszporterek (RT-CR)
NBC1
NKCC1
NHE1
ENaC
huSMG
MEM
10x
Pozitív kontroll: K: Vese
Minta jelölések:
Me: membránról izolált
Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K
Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K
Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K
Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K
Funkcionális vizsgálatok rövidzárlati áram (Isc) mérésével
Pl: plasztikról izolált
Ti: nyálmirigy szövetből
izolált
Hepato-STIM medium (BD Biosciences)
Nyálmirigy minták RNS izolálás: TRI Reagent (Sigma)
MEM medium (Sigma)
Plasztik edényről and Transwell Clearmembránról RNS izolálás:
Nucleospin RNA II. Kit (MACHEREY-NAGEL)
10%FBS, antibiotikum- antimycotikum oldat (Sigma)
Disszociáló puffer: 0,04% tripszin (Gibco) és 0,15mg/ml kollagenáz
(Sigma-Aldrich) DMEM-F12 mediumban (Gibco)
Transwell Clear (Corning Costar)
Membrán ellenállás (TEER) mérés: EVOM (World Precision Instruments)
Warner két csatornás Ussing kamra (U-2500, Warner Instruments Co.)
RT-PCR: High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied
Biosystem)
HEPES-puffer oldat, 100% O2; HCO3—puffer oldat, 5% CO2/95% O2 és
Cl—mentes oldat
amilorid (10 µM) , bumetanid (100 µM), forskolin (10 µM), ATP (50 µM),
karbakol (100 µM); (Sigma)
Eredmények
BAZOLATERALIS OLDAL
bumetanid
H+
CA II
CO2+H2O
H2CO3
cAMP
+
H++HCO3-
6
CFTR
huSMG
4
2
8
0
8
ATP
*
*
11
5
carbachol
4
forskolin
*p<0,05
vs baseline
6
2
0
HCO3Bum
5
+
-
5
+
+
9
-
9
+
*p<0,05
Na+
10 µM amilorid
2
0
ATP stimulált szekrécióra
*
4
HCO3Cl-
4
+
+
4
-
*p<0,05
8
PTHSG
6
huSMG
*
*
4
2
0
HCO3Cl-
8
+
+
5
-
8
+
+
6
-
*p<0,05
Apikálisan adott amilorid hatása
ATP stimulált szekrécióra
nem stimulált
Isc
*
4
-
karbakol
PTHSG
8
(µA/cm2)
∆Isc (µA/cm2)
PTHSG
6
ATP
HCO3-
nem stimulált
Bumetanid hatása az ATP stimulált
szekrécióra
8
ATP ADP+P
Klorid és bikarbonát megvonásának hatása
PTHSG
*
?
Cl-
Isc (µA/cm2)
∆Isc (µA/cm2)
*
Na +
+
Vektoriális iontranszport
aktiválása
8
DUCT
ATP ADP+P
HCO3-
Cl-
Cl-
APIKALIS OLDAL
NKA
Ca2+
Cl-
forskolin
Na+
NKA
K+
HCO3-
PKA II
ACINI
NBC
AE
Na+
ENaC
NHE
K+
∆Isc (µA/cm2)
NKCC1 -
Na+
PTHSG
8
6
4
2
0
HCO3-& ClAmi
9
+
-
*
*
9
+
+
3
+
*p<0,05
∆ Isc (µA/cm2)
CO2
K+
HCO3-
Na+
Cl-
Na+
Na+K+ Cl-
CaCC
Na+
8
PTHSG
6
huSMG
*
*
4
2
0
HCO3-& ClAmi
8
+
-
8
+
+
8
+
-
3
+
+
*p<0,05
Megbeszélés
 Primer sejtkultúra: polarizált epithel monolayer létrejötte mind PTHSG és huSMG kultúrából
 Hepato-STIM médium alkalmazása kulcsfaktor
 Transzepitheliális vektoriális elektrolit mozgás mindkét sejtkultúrában
1. Apikális irányú anionszekréció (Acináris jellemző)
Transwell
 Cl- és HCO3 Ca2+- aktiválta szabályozási útvonal
2. Bazolateralis irányú Na+ abszorpció (Duktális jellemző)
Apikális oldal
Cl-;HCO3ˉ Na+
Bazolaterális oldal
 Végeredmény: kétdimenziós nyálmirigyy kevert acinalis/duktális fenotípust mutatva:
működése genetikai vagy farmakológiai módosításra egyaránt alkalmas
Támogatás: TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0001; OTKA: NI69008, CK80928 ;