Transcript Előadás9
Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1 Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Folyadékkromatográfiás állófázisokról ALAK-FORMA IRREGULÁRIS – TÖRMELÉK SZEMCSÉK (POROK) GÖMBSZIMMETRIKUS – SZFEROID SZEMCSÉK SZEMCSEMÉRET ELOSZLÁS - HATÁROK >1 m GAUSSI, vagy ASZIMMETRIKUS ELOSZLÁS, HOMODISZPERZ - HETERO(POLI)-DISZPERZ SZERKEZET HOMOGÉN (TÖMÖR) SZEMCSÉK ADHÉZIÓVAL, vagy KÉMIAILAG KÖTÖTT FELÜLETI RÉTEGEK PORÓZUS (PELLICULÁRIS) FELÜLETI RÉTEGEK TÁGPÓRUSÚ (PORÓZUS, PERFUZÍV) TÖLTETEK TÖMBPOLIMER (MONOLIT) OSZLOPOK … HALMAZ ÁLLAPOT STABILITÁS Elválasztástechnika SZILÁRD (rigid, xerogél) – GÉL (liogél) – FOLYADÉK NYOMÁS, HŐ, pH, OLDÉKONYSÁG, BAKTERIÁLIS, KÉMIAI 2011 Eke Zsuzsanna A szilikagél felülete Szilikagél határfelülete (pH = 2 – 8) Határfelületen nem OH OH OH OH disszociált szilanol csoportok O Si O Si Si O O Si O Szilárd fázis O O O O Szerkezetéről kevés a megbízható információ (a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag nem stabil forma - stabil forma a kristályos szerkezet „kvarc”) H Vicinális szilanol csoportok Izolált szilanol csoportok H H O Dezaktivált szilanol csoportok H H H OH OH O O O O Si Si Si Si Si Si O O O O O O Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fémszennyezések hatása Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok Távtartó Árnyékoló Kölcsönható CH3 Si O Si CH2 CH2 CH2 CN NH2 NO2 CH(OH)-CH2(OH) CH3 C18 ….. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT FÁZISOK (RP) - OH (diol) - C2, -C4, -C8, -C18 - CN (ciano) - C6H5 (fenil) - NO2 (nitro) - etil, - NH2 (amino) - i-propil - N(CH3)2 (dimetil amino) - i-butil Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok Classic ODS Sterically Protected (non-endcapped) Conventional Conventional (endcapped) (non-endcapped) H H H * Savasan hidrolizálhat Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) NP: Az álló fázis polárisabb, mint a mozgó fázis Mikor alkalmazzuk? Apoláris vagy kevésbé poláris vegyületek meghatározására; Hexán oldható vegyületek; Helyzeti izomerek elválasztására. Állófázisok Szilikagél (40-50%); Alumínium-oxid (3-10%); Királis állófázis (20-25%); Módosított szilikagél (pl. NH2, CN, NO2, diol stb.). Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) Mozgófázisok (eluens) Apolárisabb az állófázisnál Oldja a mintát és ne reagáljon a minta komponensekkel Detektor kompatibilitás Megfelelő tisztaságú (szilárd szennyezők, O2 mentes stb.) Alacsony viszkozitású ( < 1 cP 25C-on) Könnyen beszerezhető, elfogadható áron Biztonságos (CCl4 benzol stb. egészségre káros) Könnyen keveredő Forrpont (nem túl alacsony buborékképződés miatt) Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP) RP: az álló fázis apolárisabb mint a mozgó fázis A leggyakrabban alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer (elválasztások 80%-a); Állófázisok Szilikagél alapú; (80-90%) (pH = 28); Szerves polimer alapú; (5-10%) (pH = 114); Egyéb (szén alapú, zeolit, alumínium-oxid alapú stb.; 2-10%) Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok Eluenserősség Elúciós erő Víz< Metanol<Acetonitril<Etanol<Izopropanol<Tetrahidrofurán Szelektivitás Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben pKa pKa+2 Robusztus !!! pH=2 pKa-2 Robusztus !!! K’ k !!! pH=8 pH Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Pufferekkel szemben támasztott követelmények: A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz; Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!); Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése; Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb); A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben; Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel); Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Ismétlés vége Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Izokratikus ill. gradiens elúció mAU IZOKRATIKUS tR (min) GRADIENS mAU tR (min) Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Izokratikus ill. gradiens elúció 30% ACN F C D B A 70% 20mM E Foszfát, pH=6.95 F A D C E B 50% ACN A: Feniletilamin A 50% 20mM F B: Piridin Foszfát, pH=6.95 C: 2-Picolin F 80% ACN 20% 20mM D+E D: 2,4 Lutidin E: 4-ethylpiridin B+C F: 2,3 dimetilanilin A Foszfát, pH=6.95 Az eluens erősség változása Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gradiens elúció Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gradiens elúció Pumpa, injektor, mixer, kapillárisok…. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gradiens elúció Gradiens elúció problémák: Egyensúly beállás idő; Mozgófázis tisztasága („0” –lépésként oldószer ellenőrzése); Retenciós sorrend (szelektivitás) változása; Oldószer probléma (k>10 vs. a minta oldása); Detektor kompatibilitás (pl. RI detektor). Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gradiens elúció – nyomás profil 0,56ml/perc 75% AcN Viszkozitás – összetétel összefüggés 1 ml/perc Kísérleti körülmények: Purosphere C18, 5m; 125*3mm, 25C 100% AcN 0,56ml/perc Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna HPLC pumpák fajtái Syringe Pumps Discontinuous Pumps Gas driven displacement pump Membrane Pumps Continuous Pumps Piston Pumps Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Pumpa 1. Fecskendő típus (Syringe pumpa); Áramlás <20µL/min (általában 1 - 2 µL/min) MS detektor Fecskendő pumpa Előnye: • Pulzálás mentes; • Egyszerű szerkezet; Hátránya: • Újrafeltöltést igényel; Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Pumpa Pneumatikus erősítésű (Haskel –típus); levegő levegő eluens eluens szelep Elválasztástechnika szelep 2011 Eke Zsuzsanna Diaphragm Pumps + Pressure Override Valve Oil Check Valve Piston Inlet Ball Valve Stainless Steel Diaphragm Elválasztástechnika 2011 Outlet ball Valve 26 Eke Zsuzsanna Pumpa Alternáló mozgást végző, dugattyús pumpák. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Dual Piston Parallel Pump Check Valves Pumphead Rotary Switching Valve Piston A B Single Combined Piston Delivery Delivery Piston 'A' Advancing Elválasztástechnika Piston B Retracting 2011 28 Eke Zsuzsanna Dual Piston Pump in Series Elválasztástechnika 2011 29 Eke Zsuzsanna Ballvalves for Reciprocating Piston Pumps Gold Seal Sapphire Insert Ruby Ball Spring Insert Elválasztástechnika 2011 30 Eke Zsuzsanna Pumpa Alternáló mozgást végző, dugattyús pumpák. Előnye: • Folyamatos, megbízható működés; Csoportosítás: • Egyszerű szerkezet; Alacsony nyomású; Hátránya: Magas nyomású keverést megvalósító pumpa. • Pulzálás; Oldószer kompresszibilitás kérdése!!! Pulzálás csillapító flexibilis membrán és Kompresszálható folyadék Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gradient Formation Low Pressure Gradient Elválasztástechnika High Pressure Gradient 2011 32 Eke Zsuzsanna Eluensszállító rendszer Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Pump summary The pump is the most critical piece of equipment for a successfully operating HPLC. Performance Parameters for HPLC pumps: Flow Precision Flow Range Delay Volume Pressure Pulse Composition Precision Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna MIP-Molecularly Imprinted Polimer Célvegyület Elrendeződés Célvegyület Polimerizáció (UV vagy T) Monomerek Extrakció Célvegyület - célvegyület MIP Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna MIP-Molecularly Imprinted Polimer MIP-alkalmazás Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Affinitás kromatográfia Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Affinitás kromatográfia Alkalmazások: Immunaffinitás kromatográfiával az oszlopon megkötött antitestekkel (antibodies) antigéneket tisztítunk; Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálására; Ellenanyaggal tisztíthatjuk azt a vegyületet, amely az ellenanyagot termelte; Immobilizált antitestekkel toxinokat kötnek meg vérből (hemoperfúzió); Szilárd fázisú immunoassay alkalmazásokban. Az ipar biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek ipari méretekben történő gyártására. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Affinitás kromatográfia •Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer. távtartó + ligandum + + + + + + + Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna CO-CH2 OCH2CONH(CH2)2NHCO(CH2)2COO-N + IgG-NH2 CO-CH2 távtartó NH-IgG Gél Gél Affinitás kromatográfia NH-IgG Immunoadszorbens Kapcsolások hatékonysága 60-75%; Oszlop kapacitása 8-12 mg IgG/ml gél. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Affinitás kromatográfia 1. Kondicionálás Puffer Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Affinitás kromatográfia 2. Mintafelvitel és mosás Puffer Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Affinitás kromatográfia 2. Eluálás Eluáló szer Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Affinitás kromatográfia egyensúly Minta megkötődése, Minta eluálása egyensúly Abszorbancia mAU egyéb komponensek eluálása váltás elúciós pufferre mintafelvitel 1-2 ot. x ot. 1-2 ot. >1 ot. 1-2 ot. Oszlop térfogat (ot) Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Affinitás kromatográfia Immobilizált fém affinitás kromatográfia (immobilized metal affinity chromatography - IMAC) a. Immobilizáljuk a fémet kelát képző ligandumok segítségével; b. Különböző stabilitású komplexek képződnek a fém és olyan proteinek között, amelyek elektron donor csoportot tartalmaznak (pl hisztidin, triptofán, cisztein vagy foszfát csoport). c. A komplex stabilitása függ a ligandum, fém típusától, elektron donor csoport sztérikus hozzáférhetőségétől, hőmérséklettől, pH és kompetitív donor jelenlététől. Alkalmazott pH=6-8. d. Eluálás pH gradienssel vagy a glicin, hisztidin, hisztamin, cisztein koncentrációjának növelésével (N és/vagy S tartalmú vegyületek, amelyek erős elektron donorként leszorítják a proteint a fémről). Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gélkromatográfia A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gélkromatográfia •102-108 Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztása Alkalmazások: •Polimerek, polimer adalékok vizsgálata; •Biopolimerek, peptidek, enzimek elválasztása; •Molekulatömeg eloszlás, átlag molekulatömeg meghatározás; •Minták tisztítása (peszticidek meghatározása élelmiszer mátrixból); •A minta sómentesítése; •Puffer csere. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gélkromatográfia Gél szemcse Pórusok (dp> 100A) Állófázis a kolonnában Nincs kölcsönhatás a minta- molekula és az állófázis között!! Eltérő méretű molekulákból álló minta Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gélkromatográfia Abs 265nm „Fordított szita” Idő (perc) Eltérő méretű molekulákból álló minta Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gélkromatográfia •Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat); •Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás; •Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans); lgM Teljes kizárási tartomány Mérési tartomány Teljes áteresztési tartomány Elválasztástechnika 2011 V (ml) Eke Zsuzsanna Gélkromatográfia Sómentesítés gélkromatográfiával Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gélkromatográfia Antitest tisztaságvizsgálata gélkromatográfiával Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gélkromatográfia MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Gélkromatográfia A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: 4N a M 3 3 RT a 6ND M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna