Transcript Királis és zárvány-komplex kromatográfia.

ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK
ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA
Dr. Kremmer Tibor
IX.
KIRÁLIS, ZÁRVÁNY-KOMPLEX KROMATOGRÁFIA
KROMATOFOKUSZÁLÁS
IMMOBILIZÁLT FÉMION AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM
Budapest – 2013
KIRÁLIS
ZÁRVÁNY - KOMPLEX
KROMATOGRÁFIA
A
KIRALITÁS
ELVE
Glicerinaldehid
Enantiomerek
ENANTIOMEREK ELVÁLASZTÁSA
KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIÁVAL
KÖZVETETT MÓDSZEREK
SZÁRMAZÉK KÉPZÉS KOVALENS KÖTÉSSEL,
Pl.
KIRÁLIS VEGYÜLETTEL
MARFEY – REAGENS (1-FLUORO-2,4 DINITROFENIL 5 L-ALANIN
ELVÁLASZTÁS NORMÁL, VAGY FORDÍTOTT FÁZISON
FIZIKAI-KÉMIAI TULAJDONSÁGOK ELTÉRÉSE ALAPJÁN
ELŐNYÖK
REAKCIÓ SEBESSÉG NEM BEFOLYÁSOL,
KROMATOGRÁFIA KÖRÜLMÉNYEIVEL JÓL
OPTIMÁLHATÓ, SZELEKTIVITÁS, DETEKTÁLÁS
NÖVELHETŐ, MINTA ELŐTISZTÍTHATÓ,
ANTIPÓDOK KÜLÖN ALKALMAZHATÓK
KÖVETELMÉNYEK
REAGENS OPTIKAI TISZTASÁGA,
KROMOFOR CSOPORT IGÉNYE,
MINDKÉT ANTIPÓD KELL,
REPRODUKÁLHATÓ-KVANTITATÍV REAKCIÓ,
STABIL, EGYSÉGES SZÁRMAZÉK-TERMÉK
ENANTIOMEREK ELVÁLASZTÁSA
KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIÁVAL
KÖZVETLEN MÓDSZEREK
KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA
CIKLODEXTRINEK - KORONAÉTEREK
KOMPLEX - IONPÁR KÉPZŐK
EGYÉB LIGANDUMOK
AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN (dinamikus módszerek)
AZ ÁLLÓ FÁZISON KÖTVE – KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK
(sztatikus módszerek)
KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIA
KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA
AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN
ZÁRVÁNY KOMPLEX KÉPZŐK
CIKLODEXTRIN SZÁRMAZÉKOK, KORONA ÉTEREK
TERNER KOMPLEXEK
(FÉMION – KIS LIGANDUM - ENANTIOMER)
DIASZTEREOMER – IONPÁR KÉPZŐ KOMPLEXEK AZ
ÁLLÓ FÁZIS FÁZIS FELÜLETÉN KIRÁLIS ELLENIONNAL
(KÁMFOR SZULFONSAV, KININ-KINIDIN,
PIRROLIDIN KARBONSAVAK)
KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIA
KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA
AZ ÁLLÓ FÁZISBAN
KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK
ZÁRVÁNY KOMPLEX KÉPZŐK
(KOVALENSEN KÖTÖTT CIKLODEXTRIN SZÁRMAZÉKOK, KORONAÉTEREK)
PIRKLE-TIPUSÚ FÁZISOK (3,5-DINITRO-BENZIL l-AMINOSAV)
CELLULÓZ ALAPÚ FÁZISOK
(ACETÁT, KARBAMÁT, IZOTIOCIANÁT,BENZOÁT ÉSZTEREK)
MAKROCIKLUSOS GLIKOPEPTIDEK (VANCOMYCIN)
FORDÍTOTT (REVERSED) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIÁS FÁZISOK -
MAKROMOLEKULÁRIS KÖTÖTT LIGANDUMOK
(ALBUMIN, AGP, OVOMUKOID, AVIDIN, KIMOTRIPSZIN, STB.)
LIGANDUM CSERE ELVÉN ALAPULÓ FÁZISOK
ZÁRVÁNY-KOMPLEX KÉPZŐK A KIRÁLIS KROMATOGRÁFIÁBAN
KORONA ÉTEREK
CIKLODEXTRINEK
A KIRÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK 3 PONTOS SZABÁLYA
A KIRÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK TIPUSAI
DIPOL – DIPOL
-
(SAV-BÁZIS)
H – DONOR, AKCEPTOR
TÉRIGÉNY GÁTLÁS
ZÁRVÁNY KÉPZŐDÉS
KOMPLEX KÉPZÉS,
LIGANDUM CSERE,
KIRÁLIS KÖRNYEZET (HELIX)
AROMÁS GYŰRŰ HATÁSOK,
MEREV MOLEKULA SZERKEZET
CIKLODEXTRINEK (CD)
-CD
β-CD
-CD
C36H60O30
C12H70O35
C48H80O40
6
7
8
Molekula tömeg (g/mol)
972.86
1135.01
I297.15
Specifikus optikai rotáció
(g/mol)
150.5
162. 5
177.4
Oldékonyság vizben
(súly %, 25OC)
14.50
1.85
23.20
Üregátmérő (Å)
4.7
6.0
7.5
Üregtérfogat (A3)
174
262
427
Üregtérfogat /g (ml)
0.10
0.14
0.20
6
11
17
12.33
12.20
12.08
Benzol
Naftalin
Antracén
Molekula összetétel
n (glukóz egység)
Víz ekvalens az üregben
pK3 a hidroxil csoportokra
Zárvány vegyület
A CIKLODEXTRINEK SZERKEZETE
RÖGZÍTETT MÁSODLAGOS
(C2-C3) HIDROXIL CSOPORTOK
ROTÁLHATÓ PRIMER (C6)
HIDROXIL CSOPORTOK
HIDROFÓB ÜREG
A ciklodextrinek térbeli modellje
GABA-RECEPTOR SPECIFIKUS ANALOG VEGYÜLET
(rac-NSC 382) enantiomerek (R, S) elválasztása
CELLULÓZ-p-METIL BENZOESAV ÉSZTER OSZLOPON
(CHIRALCEL OJ, DAICEL)
MolnárT, Visy J et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2008)
Oxazepam enantiomerek (R, S) királis elválasztása BSA-HPLC oszlopon
(0,01M foszfát puffer, pH: 7,0 2% ACN)
Fitos I, Visy J, Simonyi M. J. Biochem. Biophys. Methods (2002)
rac-Oxazepam és rac-oxazepam hemiszukcinát enantiomerek elválasztása
Chiral-AGP oszlopon (0,01M foszfát puffer, pH:7,0 5% ACN)
Fitos I, Visy J. et al. J Chromatogr. (1995)
KÜLÖNBÖZŐ HIDANTOIN ÉS BARBITURÁT SZÁRMAZÉKOK KIRÁLIS
ELVÁLASZTÁSA ChiraSep DN BP6 OSZLOPON (HEXÁN-2-PrOH-ACN)
KROMATOFOKUSZÁLÁS
CHROMATOFOCUSING
KROMATOFOKUSZÁLÁS
SLUYTERMAN (1977)
KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁS
IZOELEKTROMOS PONT (pI) ALAPJÁN
pH GRADIENS ELŐÁLLÍTÁSA
IONCSERE ELVÉNEK FELHASZNÁLÁSA
GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÉNEK FELHASZNÁLÁSA
KROMATOFOKUSZÁLÁS
GRADIENS KÉPZÉS
(pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS)
pH
B > A
B
A
V
KROMATOFOKUSZÁLÁS - pH-GRADIENS KÉPZÉS
KROMATOFOKUSZÁLÁS
A pH GRADIENS ALKALMAZÁSÁNAK MÓDJAI
IONCSERÉLŐ - GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETBE VEZETETT pH GRADIENS
IONOS (IONCSERÉLŐ) TÖLTETEN AMFOLITTAL KIALAKÍTOTT pH GRADIENS
INERS HORDOZÓN (GÉLSZEMCSE) KOVALENS KÖTÉSSEL RÖGZÍTETT
(IMMOBILIZÁLT) pH GRADIENS
KROMATOFOKUSZÁLÁS
IONCSERÉLŐ – GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEN
ELŐFELTÉTELEK
AZ IONCSERÉLŐ AZ ELVÁLASZTÁS TELJES pH
TARTOMÁNYÁBAN ÁLLANDÓ
(POZITÍV VAGY NEGATÍV) TÖLTÉSŰ LEGYEN
A FEHÉRJÉK BIZTOSAN KIZÁRÓDJANAK
A GÉLSZEMCSÉK PÓRUSAIBÓL
A pH GRADIENS OPTIMÁLIS SZAKASZA MEGFELELJEN
A FEHÉRJÉK IZOELEKTROMOS PONTJÁNAK
A FEHÉRJÉK IZOELEKTROMOS PONTJA AZ
ELVÁLASZTÁS pH TARTOMÁNYÁNAK KÖZEPÉN LEGYEN
4
5
pH
6
Áramlás
iránya
7
+
+
+
+
+
+
+
+
+
pI
+
(3X)
4,9
5,0
KROMATOFOKUSZÁLÁS - 1
4
5
pH
6
Áramlás
iránya
7
+
+
+
+
+
+
+
pI
(3X)
+ +
+
+
4,9
5,0
KROMATOFOKUSZÁLÁS - 2
4
pH 5
6
Áramlás
iránya
+
+
+
+
+
+
+
pI
4,9
0
0
+
0
+
5,0
KROMATOFOKUSZÁLÁS - 3
4
pH
5
6
Áramlás
iránya
+
+
+
+
+
+
+
pI
4,9
- - 0
0
5,0
KROMATOFOKUSZÁLÁS - 4
4
pH
5
Áramlás
iránya
6
+
+
+
+
+
+
+
pI
4,9
0
0

0

5,0
KROMATOFOKUSZÁLÁS - 5
4
pH
5
Áramlás
iránya
6
+
+
+
+
+
+
+
pI
4,9
- - 0
0
5,0
KROMATOFOKUSZÁLÁS - 6
4
pH
5
Áramlás
iránya
6
+
+
+
+
+
+
+
pI
4,9
0
0
0
5,0
-
-
KROMATOFOKUSZÁLÁS - 7
KROMATOFOKUSZÁLÁS
IONCSERÉLŐ – GÉLKROMATOGRÁFIÁS
TÖLTETEN
ELŐFELTÉTELEK
A FEHÉRJE IZOELEKTROMOS PONTJA AZ
ELVÁLASZTÁS pH TARTOMÁNYÁNAK KÖZEPÉN
LEGYEN
AZ IONCSERÉLŐ AZ ELVÁLASZTÁS TELJES pH
TARTOMÁNYÁBAN ÁLLANDÓ
(POZITÍV VAGY NEGATÍV) TÖLTÉSŰ LEGYEN
A FEHÉRJE BIZTOSAN KIZÁRÓDJON A
GÉLSZEMCSÉK PÓRUSAIBÓL
A pH GRADIENS OPTIMÁLIS SZAKASZA
MEGFELELJEN A FEHÉRJE IZOELEKTROMOS
PONTJÁNAK
KROMATOFOKUSZÁLÁS IONCSERÉLŐN AMFOLITTAL
MULTIFUNKCIÓS ANIONCSERÉLŐ
OSZLOP EGYENSÚLYBA HOZVA
pH = 7 PUFFERREL
ELÚCIÓ (MINTA FELVITEL)
MEGFELELŐ pI - TARTOMÁNYÚ
AMFOLITOT
(AMFOTER POLIELEKTROLIT)
TARTALMAZÓ
pH = 4,2 PUFFERREL
AZ ELUCIÓ SORÁN AZ AMFOLIT
MEGTITRÁLJA AZ IONCSERÉLŐT
ÉS pH-GRADIENST HOZ LÉTRE,
AMELYBEN A FEHÉRJE
MOLEKULÁK pI ÉRTÉKÜKNEK
MEGFELELŐEN KÖTÖDNEK ÉS
KÜLÖNBÖZŐ RETENCIÓVAL
OLDÓDNAK LE
REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL
(Cytochrom C – Ribonuclease – Lentil-lectin)
L – Aminosav oxidáz izoenzimek elválasztása
kromatofokuszálással Mono P oszlopon
HAEMOGLOBIN
VARIÁNSOK
ELVÁLASZTÁSA
KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL
IZOM FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL
TOJÁS FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL
IMMOBILIZÁLT FÉM ION
(KELÁT - KOMPLEX)
AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA
IMAC
IMMOBILIZED METAL ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY
IMMOBILIZÁLT FÉM ION (KELÁT-KOMPLEX) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA
IMAC