Transcript Gélkromatográfia.

ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK
ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA
Dr. Kremmer Tibor
VI.
FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK
GÉLKROMATOGRÁFIA
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM
Budapest – 2013
GÉLKROMATOGRÁFIA
GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION
MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA
SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
SEC
GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA
GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY
GPC
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS
McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok
Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés
Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS
Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek
Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath (1961-63)
Size Exclusion Chromatography (SEC)
Méret szerinti kizáródásos kromatográfia
Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell
Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography
Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography
A molekula „szitálás” matematikai modellje
Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC)
Casassa (1967), Ogston (1968-70) Termodinamikai értelmezés
Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján
Determann (1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA
A GÉLKROMATOGRÁFIA
ELVÁLASZTÁSI
MECHANIZMUSÁNAK
SZTERIKUS
ELMÉLETI
MODELLJE
Térhálós szerkezetű polidextrán alapú xerogél (Sephadex) pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.
PORÓZUS SZILIKA GÉL ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE
Biológiai aktivitás
GÉLKROMATOGRÁFIA
Molekula méret-tömeg, eloszlás
Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek
Fizikai tulajdonságai:
Oldékonyság (poláris-apoláris)
Szolvatáció – hidratáció
Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció
Hidrodinamikai jellemzők
Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó,
belső viszkozitás, flexibilitás
AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA
OMATOGRÁFIA
pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG
VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ)
ADALÉKOK
detergensek,
stabilizálók,
antioxidánsok,
antibakteriális vegyületek, stb,
GÉLKROMATOGRÁFIA
AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS
A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE
Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás,
SZERVETLEN OXIDOK
SiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, üvegszemcsék (CPG),
SZERVES POLIMEREK
Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metakrilát, poliéterKEVERT TÍPUSOK
Szervetlen-szerves - Si02- poliszacharid,
Szerves-szerves – dextrán - agaróz,
Egyéb polimerek - akrilamid - PS-DVB
AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)
TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE
N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK
GFC - SEC
IL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
Elnevezés
Összetétel
Gyártó - Forgalmazó
Sephacryl
S 100 -1000
Allil - dextrán akrilamid
Pharmacia-LKB
Superdex 30-200
Dextrán-agaróz
Pharmacia-LKB
SynChrom GPC
Polipropil-gliceril
Waters- Millipore
Sigmachrom
GFC 100-300
Dextrán - polietilénglikol
Sigma-Aldrich
Chitopearl Chitopack Kitin – kitosan poliszacharid
Fuji Spinning Co. (Japán)
Nucleosil
Phenomenex GPC-P
Daisogel 2205
SiO2
Macherey-Nagel
Phenomenex Daiso
(Japán)
Unisphere
Al2O3
Biotage
HA Type 8
Hidroxiapatit
Koken Science
C – SEC
IL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
Elnevezés
Összetétel
Gyártó-Forgalmazó
Styragel HMW
PS – DVB
Waters
Fractogel TSK
Szilikagél, ill.
Merck
G 3000 SW-PW
Polivinil - sztirol polimer
Toyopearl HW 55F
TosoHaas
Metachem GPC 102 106
PS - DVB
Metachem Tecnol.
Jordi Gel DVB 500
Polidivinil benzol
Jordi Associates
BioSep SEC
2000-4000
PS - DVB
Phenomenex
Asahipak HO
Polivinil alkohol
Asahi Chem. Co.
PL gel MIXED
Polietilénnel kevert
PS-DVB
Polymer
PL Aquagel OH
Polihidroxid
Polihidroxil Lab Ltd,
Shodex UT 800
KF 80 M
Poliszachariddal kevert
PS – DVB kopolimer
Showa Denko
i HPLC-SEC oszloptöltetek
molekulák, biopolimerek elválasztására
Elnevezés
Összetétel
Gyártó-Forgalmazó
Sepharose CL 2B, 4B, 6B
Dextrán-agaróz
Pharmacia LKB
Sephacryl S 200, S 300
Dextrán-akrilát
Pharmacia LKB
Styragel HMW
PS – DVB
Waters
Fractogel TSK
Szilikagél, ill. polimer
Merck
TSKgel
Polivinil - sztirol polimer
TosoHaas
Toyopearl HW 55F, -75
Etilénglikol/metakrilát kopolimer
TosoHaas
Shodex HA 30
Hidrofil PS - DVB
TosoHaas
Shodex UT 800 KF 80 M
Poliszachariddal kevert PS – DVB
Showa Denko
PL aquagel OH
Polihidroxid- polimer gyanta
Polymer Laboratories
PL gel MIXED
Polietilénnel kevert PS-DVB
Polymer Laboratories
Phenogel OH
Hidrofil polimer gyanta
Polymer Laboratories
NUCLEOGEL GFC
Hidrofil polimer gyanta
Macherey-Nagel
BioSep SEC 2000-4000
PS – DVB
Phenomenex
Asahipak HO
Polivinil alkohol
Asahi Chem. Co.
Jordi Gel DVB 500
Polidivinil benzol
Jordi Associates
Metachem GPC 102 - 106
PS - DVB
Metachem Technology
G 3000 SW-PW
Sephadex G gélek kromatográfiás tulajdonságai
Géltípus
Gélágy térfogata
cm3/g xerogél*
Kizáródási
moltömeg (kDa)
Frakcionálási
tartomány (kDa)
G-10
2–3
≈ 0,7
0,7 alatt
G-15
2,5 – 3 – 5
≈ 1,0
1,0 alatt
G-25
4–6
5
1 –5
G-50
9 – 11
30
1,5 – 30
G-75
12 – 15
70
3 – 70
G-100
15 – 20
150
4 – 150
G-150
20 – 30
400
5 – 400
G-200
30 – 40
800
5 - 800
A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően:
durva (coarse) 100-300, közepes (medium) 50-150,
finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) 10-40 lehet.
HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK
(BioBeads, 5 m) SEM KÉPE
HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK
HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE
HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS
SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI
A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE
Ve  Vo  K av (Vt  Vo )
1
V o  Vt
3
K av
Ve  Vo

Vt  Vo
K av  0  1
AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE
A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %)
Agaróz
0.3 – 1.5
Sephadex
3 - 30
Poliakrilamid
2.5 - 15
A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) !
ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET
A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a
térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek.
A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet
sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az
oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.
Az elválasztás technika szemlélete szerint a
GÉLKROMATOGRÁFIA
a FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA
SPECIÁLIS HATÁRESETE
ahol az álló és az áramló fázis ugyanaz az oldószer,
a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák.
Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA
a fázisok közötti térfogati megoszlás
(fázisarány, megoszlási együttható)
a molekula méretének (tömegének) függvénye.
Kav 
Ve  Vo
~ f(log M)
Vt  Vo
(A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)
BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK)
MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
log M  Ve / V0 = Kav (Vt – V0)
(Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt
Kav = 0 – 1
log M  Kav
Determann egyenletek (1966-69)
Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre
logM = M0 - (6.06-5.00
) Ve
Vo
 = a xerogél szemcse sűrűsége
MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval
A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE
A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula
tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula
fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le:
4N a
M

3 
3
M – molekulatömeg,
a – Stokes-féle rádiusz,
υ – molekula fajlagos parciális térfogata,
RT
a
6ND
N – Avogadro-féle szám,
D – diffuziós állandó,
η – viszkozitási együttható.
A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS
ALKALMAZÁSI TERÜLETEI
PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI
OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA
BEKONCENTRÁLÁS
SÓMENTESÍTÉS
PUFFER CSERE
CSOPORT FRAKCIONÁLÁS
TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS
MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS
DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA
KROMATOFOKUSZÁLÁS
MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C5-C58) ELVÁLASZTÁSA
MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
HUMÁN
SZÉRUM
CHYLOMICRON
VLDL
LIPO
PROTEIN
OSZTÁLYOK
(SEM)
A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA
DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE
HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA
ELFO
VLDL
LDL
HDL
UC
HUMÁN SZÉRUM
LIPOPROTEINEK
ELVÁLASZTÁSA
ELEKTROFORÉZISSEL
AGARÓZ GÉLEN
LDL
HUMÁN SZÉRUM
LIPOPROTEINEK
SEC
ELVÁLASZTÁSA
VLDL
AGARÓZ
(Sepharose 6B)
HDL
GÉLOSZLOPON
PLAZMA MEMBRÁN ÖSSZETEVŐK SZOLUBILIZÁLÁSA DETERGENSEKKEL
(SDS - Na-dodecil szulfát)
SDS
(900 – 5 min)
Detergens
Sejtmembrán
Fehérje és lipid micellák
-o-●-
-X-
Májsejtek plazma membrán fehérje és lipid tartalmának elválasztása
detergens gélkromatográfiával Sepharose 4B oszlopon.