ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA

Dr. Kremmer Tibor

IV.

FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK

NORMÁL ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA

EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM

Budapest – 2013

NORMÁL ÁLLÓ FÁZISOK

Szervetlen : SiO 2 - Al 2 O 3 – MgO – ZnO – Florisil - TiO 2 - ZrO 2

stb.

Szerves :

Agaróz, polidextrán (Sephadex), poliakril amid polisztirol-divinil benzol, polimetil metakrilát alapú gélek, cellulóz, poliamid, csontszén,

KÖTÖTT ÁLLÓ FÁZISOK

(bonded phases)

/ \ NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT (apoláris) FÁZISOK – OH

(diol)

(RP, reversed phases) – CN (ciano) – alifás alkil lánccal (C2, C4, C8, C18) – NH – SO 3 2 (amino propil) – fenil – N(CH 3 ) 1-3 – i-propil (mono-, di-, trimetil amino) – i-butil H (szulfo propil) – ciklohexil – NO 2 (nitro) HILIC– hidrofil kölcsönhatású HIC - hidrofób kölcsönhatású töltetek (anion- és kation cserélők) kromatográfiás töltetek

KROMATOGRÁFIA

ADSZORPCIÓS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA ÁLLÓ FÁZISA

SiO 2 - Al 2 O 3 – MgO – ZnO – TiO 2 – ZrO 2 CaO – CaSO 4 (gipsz) – CaCO 3 – Ca 3 (PO 4 ) 2 Mg-Al-szilikátok ( Florisil) (hidroxi apatit) Csontszén (C – PGC), cellulóz, poliamid

LC – HPLC ~ TLC

ADSZORPCIÓS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA ÁRAMLÓ FÁZISA

APOLÁRIS, vagy KÖZEPESEN APOLÁRIS OLDÓSZER(ELEGYEK) Kirkland

szerint a legtöbb adszorpciós elválasztási feladat az alábbi nyolc oldószerrel, vagy optimális kombinációjukkal megoldható:

hexán – CH 2 Cl 2 – CHCl 3 – (metil-t-butil)éter – CH 3 OH – CH 3 CN – THF – H 2 O

Más szerzők a növekvő elúciós erő (polaritás) sorrendjében hasonló oldószer (eluotróp) sorozatot ajánlanak:

petroléter(hexán)–ciklohexán–széntetraklorid–toluol–diklórmetán–éter– kloroform–aceton–etilacetát–propanol–etanol–víz–ecetsav .

Az adszorpciós kromatográfia elválasztási folyamatainak tényezői

(oxid típusú mezopórusos állófázisoknál) Dipól-dipól, hidrogén-híd és  -komplexek képződésén alapuló permanens, orientációs és indukált intermolekuláris kölcsönhatások.

A reverzibilis kötési tulajdonságokat elsősorban az adszorbens felületén igénybe vehető ún. aktív helyek száma és minősége határozza meg.

- Az elválasztás mechanizmusa azon az elméleti megközelítésen alapul, hogy a különböző kölcsönhatások energiaváltozásainak eredményeként az adszorbens aktív helyein versengés van az elválasztandó anyagok és az oldószer molekulák között. - Az adszorbensek aktivitása egyrészt fajlagos felületükkel (m 2 g -1 ), másrészt az elválasztandó vegyület típusokra specifikusabb és sokkal informatívabb adszorpciós erejével (kromatográfiás aktivitásával) jellemezhető.

Vegyület csoportok szerint az adszorpció erőssége a következő sorrendben növekszik: alkánok, telített szénhidrogének, - olefinek, aromás szénhidrogének, szerves halogén vegyületek, éterek, észterek, szulfidok, nitro-származékok, - aldehidek, - ketonok, alkoholok, - aminok, amidok, szulfonok, szulfoxidok, - karbonsavak.

H H O

A SZILIKAGÉL SZERKEZETE

H O H H O H H O H

RÉTEGKROMATOGRÁFIA

Elválasztott frakciók Oldószer áramlás Iránya (front) Réteglap Oldószer (áramló fázis) ☼ ☼ ☼ Minta felvitel helye (start)

EGÉSZSÉGES ÉS DAGANATOS PAJZSMIRIGY MINTÁK LIPID TARTALMÁNAK RÉTEGKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA TUMOR NOR CHOL TG SERUM

POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK (ZSÍROK) TLC ANALIZISE EGYDIMENZIÓS KÉT LÉPÉSES ELVÁLASZTÁS 1. - LÉPÉSBEN: CHCl 3 -MeOH-AcOH (35-25-4) 2. - LÉPÉSBEN: HEXÁN-ÉTER-AcOH (85-15-3) ELŐHIVÁS: PMS

POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK EGYDIMENZIÓS-KÉTLÉPÉSES RÉTEGKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA ELŐHÍVÁS: SZENESÍTÉS

POLÁRIS (FOSZFOR)LIPIDEK KÉTDIMENZIÓS RÉTEGKROMATOGRÁFIÁJA

Előhivás: PMS

C:M:AcOH

FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA PAPÍRKROMATOGRÁFIA Consden, Gordon és Martin (1944) Cellulózrostok (por) - vizes oldószer rendszerek FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA Howard és Martin (1950) Normál fázis (SiO 2 ) – squalen/paraffin olaj Áramló fázis: poláris oldószerelegyek

SiO 2

HIDROFIL KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography – HILIC) Kötött normál poláris állófázisok (ioncserélők, diol, ciano, amino, stb.) Vízzel (pufferrel) elegyedő apoláris oldószer (acetonitril, dioxán, THF), amely a töltet felszínén egy állandó, vízben gazdag réteget tart fenn és különböző poláris kölcsönhatások kialakulása révén az elválasztandó anyagok szelektív megoszlását eredményezi. (Alpert, 1990)

FORDÍTOTT FÁZISÚ

(REVERSED PHASE, RP-LC)

FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

Prof. J.F.K. Huber Prof. Horváth Cs. Prof. Halász I.

Schematic illustration of the surface of the alkyl-silica bonded phases most widely used in reversed-phase chromatography. The octadecyl-silane junctions are bound via siloxane bridges to the surface of silica gel still containing some polar silanol residues. (Horváth és mtsai, 1966)

FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

• A fordított fázis (Reversed Phase, RP) elnevezés arra utal, hogy ebben a rendszerben az álló és áramló fázisok polaritása a normál fázisú rendszerekkel ellentétben „fordított” elrendezésű. • Ennek megfelelően a fordított fázisú folyadék kromatográfiában áramló fázisként polárisabb oldószereket , leggyakrabban a víz és metanol, etanol, acetonitril, aceton, dioxán, n- és i-propanol, tetrahidrofurán, stb. elegyeit alkalmazzák.

• A normál és fordított fázisú folyadék kromatográfiás módszereket összehasonlítva - a normál fázisú rendszerekben és a minta kölcsönhatása az elválasztást elsősorban az állófázis határozza meg, míg - a fordított fázisok fázis tulajdonságai alkalmazásakor az elválasztást inkább a mozgó (polaritás, oldószer elegyek, adalékok) modulálják, A töltet-minta kölcsönhatása ebből a szempontból másodlagos tényezőnek tekinthető.

A „FORDÍTOTT” FÁZISÚ FOLYADÉK KROMATOGRÁFIA Az „ELV” Horváth Csaba Professzor úr tolmácsolásában Horváth Cs.:Reversed-phase chromatography.

Trends in Anal Chem 1 (1981) 6-12.

RP-HPLC

ÁLLÓ FÁZISOK FEJLESZTÉSE MŰSZER FEJLESZTÉS

Jellemzői - előnyei

Egyszerű - hatékony - szelektív Gradiens elúció alkalmazható Vegyületcsoportok széles skáláján használható Sokoldalúan használható (RP, adalékokkal SAX, SCX) Detektálás (UV-VIS, FLU, RI, IR, LSD, VEZ, MS) tág lehetőségei Kereskedelmi termékek széles választéka

Hátrányai

Alacsony retenció az erősen poláris (ionos) vegyületekre Szolvát burok változása (dewetting, collapsing) Töltetek (SiO 2 ) instabilitása, tulajdonságai (pH, Si-OH), reprodukálhatósága

Daganatsejtek plazma membrán szfingomielin frakcióinak elválasztása HP-RP18 oszlop (25x0,46 cm, 5  m) Izokratikus elúció, metanol-5 mM foszfát puffer, pH 7,4 (95:5 v/v) oldószer elegy .

T: 250C, áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, detektálás: 205 nm. (Kremmer, 1988)

A B C Természetes oligo(poli)aminok danzil származékainak RP-HPLC elválasztása Nucleosil C18 oszlopon (20x0,46 cm, 5  m), 10 mM ammónium foszfát (pH 4,4)-acetonitril (1:1) és acetonitril-metanol (37:3) gradiens elúcióval. A – Referencia vegyületek, B – humán vizelet minta és C – humán szérum poliamin spektruma. (Kremmer és mtsai, 1984)

Humán szérum savanyú alfa-1 glikoprotein (AGP) tripszines emésztési termékeinek elválasztása Vydac 218WP54 (300P wide pore C18, 25x0,46 cm, 5 acetonitril (5:95) (v/v) oldószereleggyel.  m) oszlopon lineáris gradiens elúcióval, 0,1% trifloroecetsavat tartalmazó A – víz-acetonitril (95:5) és B - víz-

.

A B Nukleotid foszfátok (A - CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP) és a kritikus párok (B – CMP-UMP, IMP-GMP, OMP-AMP) elválasztása fordított fázisú ion-pár folyadékkromatográfiával. Nucleosil ODS oszlop (25x0,46 cm, 5  m) lineáris gradiens elúció. Áramló fázis: 0,08 mM NaCl 0,025 M tetrabutil ammonium foszfát puffer (pH 6,0), Áramlási sebesség: 0,75 ml/perc, detektálás: 254 nm (Kremmer és mtsai, 1987).

.

Adenozin trifoszfát (ATP) retenciós tényezőjének változása az ion-pár RP-HPLC paramétereinek (NaCl, metanol) függvényében

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET