Transcript ELV-TECH_III

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA
III.
GÉLKROMATOGRÁFIA
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
Dr. Kremmer Tibor
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM
Budapest
GÉLKROMATOGRÁFIA
GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION
MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA
SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
SEC
GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA
GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY
GPC
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS
McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok
Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés
Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS
Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek
Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath (1961-63)
Size Exclusion Chromatography (SEC)
Méret szerinti kizáródásos kromatográfia
Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell
Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography
Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography
A molekula „szitálás” matematikai modellje
Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC)
Casassa (1967), Ogston (1968-70) Termodinamikai értelmezés
Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján
Determann (1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA
A GÉLKROMATOGRÁFIA
ELVÁLASZTÁSI
MECHANIZMUSÁNAK
SZTERIKUS
ELMÉLETI
MODELLJE
PORÓZUS GÉLSZERKEZET ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE
Biológiai aktivitás
GÉLKROMATOGRÁFIA
Molekula méret-tömeg, eloszlás
Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek
Fizikai tulajdonságai:
Oldékonyság (poláris-apoláris)
Szolvatáció – hidratáció
Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció
Hidrodinamikai jellemzők
Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó,
belső viszkozitás, flexibilitás
AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA
OMATOGRÁFIA
pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG
VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ)
ADALÉKOK
detergensek,
stabilizálók,
antioxidánsok,
antibakteriális vegyületek, stb,
GÉLKROMATOGRÁFIA
AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS
A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE
Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás,
SZERVETLEN OXIDOK
SiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, üvegszemcsék (CPG),
SZERVES POLIMEREK
Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metak-rilát, poliéterKEVERT TÍPUSOK
Szervetlen-szerves, Szerves-szerves, Si02-poliszacharid
AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)
TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE
N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK
MATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
PC-SEC, PITTCON 1993-94)
Elnevezés
Összetétel
Gyártó - Forgalmazó
Sephacryl
S 100 -1000
Allil - dextrán akrilamid
Pharmacia-LKB
Superdex 30-200
Dextrán-agaróz
Pharmacia-LKB
SynChrom GPC
Polipropil-gliceril
Waters- Millipore
Dextrán - polietilénglikol
Sigma-Aldrich
Kitin - kitosan
poliszacharid
Fuji Spinning Co. (Japán)
SiO2
Macherey-Nagel
Phenomenex Daiso
(Japán)
Unisphere
Al2O3
Biotage
HA Type 8
Hidroxiapatit
Koken Science
Sigmachrom
GFC 100-300
Chitopearl
Chitopack KO
Nucleosil
Phenomenex GPC-P
Daisogel 2205
MATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
PC-SEC, PITTCON 1993-94)
Elnevezés
Összetétel
Gyártó-Forgalmazó
Styragel HMW
PS – DVB
Waters
Fractogel TSK
Szilikagél, ill.
Merck
G 3000 SW-PW
Polivinil - sztirol polimer
Toyopearl HW 55F
TosoHaas
Metachem GPC 102 106
PS - DVB
Metachem Tecnol.
Jordi Gel DVB 500
Polidivinil benzol
Jordi Associates
BioSep SEC
2000-4000
PS - DVB
Phenomenex
Asahipak HO
Polivinil alkohol
Asahi Chem. Co.
PL gel MIXED
Polietilénnel kevert
PS-DVB
Polymer
PL Aquagel OH
Polihidroxid
Polihidroxil Laboratories
Ltd,
Shodex UT 800
KF 80 M
Poliszachariddal kevert PS DVB
Showa Denko
Sephadex G gélek kromatográfiás tulajdonságai
Géltípus
Gélágy térfogata
cm3/g xerogél*
Kizáródási
moltömeg (kDa)
Frakcionálási
tartomány (kDa)
G-10
2–3
≈ 0,7
0,7 alatt
G-15
2,5 – 3 – 5
≈ 1,0
1,0 alatt
G-25
4–6
5
1 –5
G-50
9 – 11
30
1,5 – 30
G-75
12 – 15
70
3 – 70
G-100
15 – 20
150
4 – 150
G-150
20 – 30
400
5 – 400
G-200
30 – 40
800
5 - 800
A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően:
durva (coarse) 100-300, közepes (medium) 50-150,
finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) 10-40 lehet.
HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK
(BioBeads, 5 m) EM KÉPE
HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK
HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE
HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS
SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI
A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE
Ve  Vo  K av (Vt  Vo )
1
V o  Vt
3
K av
Ve  Vo

Vt  Vo
K av  0  1
AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE
A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %)
Agaróz
0.3 – 1.5
Sephadex
3 - 30
Poliakrilamid
2.5 - 15
A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) !
ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET
A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a
térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek.
A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet
sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az
oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.
Az elválasztás technika szemlélete szerint a
GÉLKROMATOGRÁFIA
a FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA
SPECIÁLIS HATÁRESETE
ahol az álló és az áramló fázis ugyanaz az oldószer,
a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák.
Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA
a fázisok közötti térfogati megoszlás
(fázisarány, megoszlási együttható)
a molekula méretének (tömegének) függvénye.
Kav 
Ve  Vo
~ f(log M)
Vt  Vo
(A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)
BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK)
MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
log M  Ve / V0 = Kav (Vt – V0)
(Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt
Kav = 0 – 1
log M  Kav
Determann egyenletek (1966-69)
Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre
logM = M0 - (6.06-5.00
) Ve
Vo
 = a xerogél szemcse sűrűsége
MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval
A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE
A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula
tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula
fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le:
4N a
M

3 
3
M – molekulatömeg,
a – Stokes-féle rádiusz,
υ – molekula fajlagos parciális térfogata,
RT
a
6ND
N – Avogadro-féle szám,
D – diffuziós állandó,
η – viszkozitási együttható.
A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS
ALKALMAZÁSI TERÜLETEI
PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI
OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA
BEKONCENTRÁLÁS
SÓMENTESÍTÉS
PUFFER CSERE
CSOPORT FRAKCIONÁLÁS
TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS
MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS
DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA
KROMATOFOKUSZÁLÁS
MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C5-C58) ELVÁLASZTÁSA
MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
HUMÁN
SZÉRUM
CHYLOMICRON
VLDL
LIPO
PROTEIN
OSZTÁLYOK
(SEM)
A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA
DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE
HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA
ELFO
VLDL
LDL
HDL
UC
HUMÁN SZÉRUM
LIPOPROTEINEK
ELVÁLASZTÁSA
ELEKTROFORÉZISSEL
AGARÓZ GÉLEN
LDL
HUMÁN SZÉRUM
LIPOPROTEINEK
SEC
ELVÁLASZTÁSA
VLDL
AGARÓZ
(Sepharose 6B)
HDL
GÉLOSZLOPON
SZOLUBILIZÁLÁS ÉS DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA
DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA MEMBRÁN FEHÉRJÉK
ELVÁLASZTÁSÁRA ÉS TISZTÍTÁSÁRA
IONCSERÉLŐ
FOLYADÉK
KROMATOGRÁFIA
(IEX)
Ion Exchange
Chromatography
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS
Ószövetség (Exodus xv. 23-5) víz tisztítás
Arisztotelész (cit. Hellferich, 1959) tengervíz sótlanítás
Bacon (XVII. sz. eleje) alkimia, gyógyszerészet, derítés-perkolálás
Thompson (1850), Way (1852) kationok adszorpciója agyagon
Eichorn (1858), Boedecker (1859)
egyensúlyi folyamatokra empirikus egyenletek
Harms (1896) cukorgyártásban szabadalom
Harms és Rümpler (1903) szervetlen szintetikus ioncserélők
Gans (1905) Al-szilikátok alkalmazása vízlágyításra
Fischer és Hoffmeister (1910-20) Kuhn, Lederer és Winterstein
(1932-35) fehérje kémiai alkalmazások, tisztítás
elválasztás
Adams és Holmes (1935- ) polimerkémia, szerves ioncserélők,
PDB műgyanták, bakelit (hanglemez !)
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK)
ÖSSZETEVŐK IONOS, vagy IONIZÁLHATÓ TULAJDONSÁGA
FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK TÖLTÉSE ÉS MINŐSÉGE
IZOELEKTROMOS PONT (makromolekula, biopolimer)
A TÖLTÉS VISZONYOK (net charge) VÁLTOZÁSA
A pH ÉS IONERŐSSÉG HATÁSÁRA
MOLEKULA TÖMEG ÉS SZERKEZET
DETEKTÁLHATÓSÁG
BIOLÓGIAI AKTIVITÁS
OLDÉKONYSÁG
STABILITÁS
FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK
IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ÁLLÓ FÁZIS – IONCSERÉLŐ TÖLTETEK
GYENGE - ERŐS
~~N+H2 < ~~N+HR < ~~N+R2 < ~~N+R3
erősen szubsztituens (R) függő
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
IONCSERÉLŐ TÖLTETEK
KATION CSERÉLŐK
Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, CM, PO4)
ANION CSERÉLŐK
Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner
amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal
AMFOTER (kevert) TIPUSOK
Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex
szerkezettel
ERŐS - GYENGE
IONCSERÉLŐK
DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT
„TENTACLE” ELV - KAPACITÁS !
ROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
Elnevezés
Összetétel (matrix)
Gyártó - Forgalmazó
Dowex A (WBA)
C 88
Sztirol divinil benzol
SIGMA
Amberlit IR
Sztirol divinil benzol
SERVA
Dextrán-agaróz kopolimer
Pharmacia-LKB
Polivinil sztirol kopolimer
Pharmacia-LKB
Sepharose Q, DEAE,
ANX, SP, CM,
BioBeads MonoQ
MonoP, MonoS
Fractogel EMD
DEAE 650
TMAE 650
SO3- 650
AG MP, 50W, X4
Poli metilmetakrilát
Sztirol divinil benzol
Akrilát
Poliamin
Merck, Darmstadt
BioRad Laboratories
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS
A LEGFONTOSABB MODULÁLÓ TÉNYEZŐK
KÉMHATÁS - pH - PUFFEREK
AZ IONCSERE EGYENSÚLYI FÁZISÁBAN
A MEGFELELŐ ELLENION ÉS AZ
IONCSERÉLŐ TÖLTÉSÉNEK BIZTOSÍTÁSA
AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) TÖLTÉSÉNEK
KIALAKÍTÁSA (pozitív, vagy negatív, pl. fehérjék)
AZ IONCSERE pH-val MODULÁLT ELÚCIÓS FÁZISÁBAN
AZ ELVÁLASZTANDÓ VEGYÜLETEK
ÉS AZ IONCSERÉLŐ
IONOS KÖLCSÖNHATÁSAINAK
SZELEKTÍV MEGVÁLTOZTATÁSA
AZ IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁBAN
ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT PUFFER RENDSZEREK
Puffer
pH tartomány
Citrát (-dihidrogén, -hidrogén)
2 - 6,0
2,6 - 6,5
Ammónium foszfát
2,2 - 6,5
Kálium hidrogén ftalát
2,2 - 6,5
Nátrium formiát
3,0 - 4,4
Nátrium acetát
4,2 - 5,4
Trietanolamin
6,7- 8,7
Nátrium borát
8,0 - 9,8
Ammónium acetát
8,6-9,8
Nátrium dihidrogén foszfát
2,0-6,0 és 8,0-12,0
Kálium dihidrogén foszfát
2,0-8,0 és 9,0-13,0
Bis-tris-propán
4.0 – 8.0
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS
IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG
1
2
I   ci  z i
2
összefüggésből számítható, ahol:
ci
z i2
az i-edik ion koncentrációja,
az i-edik ion töltés számának négyzete.
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS
POLARITÁS
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS POLARITÁSÁNAK VÁLTOZTATÁSA
(CSÖKKENTÉSE) ADALÉK OLDÓSZEREKKEL
METANOL, ACETONITRIL
AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK ERŐSSÉGÉNEK
VÁLTOZTATÁSA
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
MUNKAFOLYAMATAI
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
EGYENSÚLYI ÁLLAPOT BEÁLLÍTÁSA
(EKVILIBRÁLÁS)
AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAGOK KÖTŐDÉSÉRE
AZ EGYÉB (KONTAMINÁNS) ANYAGOK ELKÜLÖNÍTÉSÉRE
A MEGFELELŐ ÁLLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK OPTIMÁLÁSA
pH, IONERŐSSÉG-MINŐSÉG, POLARITÁS
KEMOSZORPCIÓ
AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN OLDOTT MINTA
KÖLCSÖNHATÁSBA HOZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL
AZ EGYÉB (NEM KÖTŐDŐ) ANYAGOK LEOLDÁSA AZ
ÁRAMLÓ FÁZISSAL
(ELÚCIÓ)
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
A DESZORPCIÓ MŰVELETEI
(ELVÁLASZTÁS, FRAKCIONÁLÁS)
AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK SZELEKTÍV MEGBONTÁSA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK
pH, IONERŐSSÉG, POLARITÁS
SZISZTEMATIKUS
SZAKASZOS és/vagy FOLYAMATOS, EGYIDEJŰ vagy KÜLÖNÁLLÓ
VÁLTOZTATÁSÁVAL
IZOKRATIKUS ELUCIÓ
GRADIENS ELUCIÓ
AZ ELUENS PARAMÉTEREINEK VÁLTOZTATÁSA
SZAKASZOS - LÉPCSŐZETES
LINEÁRIS, vagy EGYÉB
(KONVEX, KONKÁV, stb.) FÜGGVÉNYKAPCSOLAT SZERINT
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
GRADIENS KÉPZÉS
(pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS)
pH
B > A
B
A
V
A GRADIENS ELÚCIÓ FORMÁI ÉS ALKALMAZÁSA
21
TERMÉSZETES
AMINOSAV
IONCSERÉLŐ
KROMATOGRÁFIÁS
ELVÁLASZTÁSA
Dionex DC-6A
ANIONCSERÉLŐ
OSZLOPON
(30X0,46 cm)
3 LÉPÉSES
Na-citrát gradiens
PROGRAMMAL
DETEKTÁLÁS:
NINHIDRIN
(post-column)
TERMÉSZETES AMINOSAVAK FMOC SZÁRMAZÉKAINAK
ELVÁLASZTÁSA IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL
FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK
IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI
ENZIMEK TISZTITÁSA CSIRKE IZOMBÓL KATIONCSERÉLŐ (Mono S)
KROMATOGRÁFIÁVAL
CELLULÁZ TRIPSZINES EMÉSZTÉSI TERMÉKEINEK ELVÁLASZTÁSA
ANIONCSERÉLŐ (Mono Q) KROMATOGRÁFIÁVAL
KÍGYÓMÉREG ÖSSZETEVŐINEK ELVÁLASZTÁSA KATIONCSERÉLŐ
FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
HbA1C ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE KATIONCSERÉLŐ (Mono S)
KROMATOGRÁFIÁVAL
HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA
HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL
LAKTÁT DEHIDROGENÁZ (LDH) IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA
KATION CSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
VIZELET FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA ANIONCSERÉLŐ (Mono Q)
KROMATOGRÁFIÁVAL
- LIGHT CHAINS FEHÉRJE KIMUTATÁSA KÓROS VIZELETBEN
(MYELOMA MULTIPLEX)
HUMÁN SZÉRUM
AGP
ELVÁLASZTÁSA
ÉS MÉRÉSE
ANIONCSERÉLŐ
KROMATOGRÁFIÁVAL
KETTŐS
pH – NaCl
GRADIENSSEL
pH
7,5  9,5
NaCl 0  350 mM
NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE IONCSERÉLŐ
MonoQ – FPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
MINTAELŐKÉSZÍTÉS:
Szövetek, sejtek, biológiai
folyadékok homogenizálva 0,7M
perklórsavban, centrifugálás,
felülúszó semlegesítve KHCO3-al
FPLC oszlop:
MonoQ, v. Polyanion SI HR 5/5
Áramló fázis:
NH4-foszfát puffer, pH: 7, 0
Gradiens elúció: 0,1 – 1, 0 M
Program szerint
Áramlási seb: 0,75 mL/perc
Detektálás: 254 nm
NUKLEOZIDOK ÉS NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA
ION-PÁR HPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
(Ade, Cyt, Gua, Uri, CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP)
MINTAELŐKÉSZÍTÉS:
Szövetek, sejtek, biológiai
folyadékok homogenizálva
0,7M perklórsavban,
centrifugálás
felülúszó
semlegesítve KHCO3-al
HPLC oszlop:
Hypersil ODS
(25x0,46 cm, 5 m)
Áramló fázis:
0,025M TBAH-foszfát
pH: 6,0 és 0,08M NaCl
Lineáris gradiens elució:
MeOH 0-20% (v/v) 45perc
Áramlási seb: 0,75 mL/perc
Detektálás: 254 nm
A HPLC-ION PÁR KROMATOGRÁFIA PARAMÉTEREINEK ÖSSZEFÜGGÉSE
k’ VÁLTOZÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS MeOH ÉS NaCl TARTALMÁNAK FÜGGVÉNYÉBEN
A NUKLEOTID FOSZFÁTOK
ELVÁLASZTÁSÁNAK
OPTIMÁLÁSA
AZ
ÁRAMLÓ FÁZIS
MeOH és/vagy NaCl
KONCENTRÁCIÓJÁNAK
VÁLTOZTATÁSÁVAL
HPLC oszlop:
Hypersil ODS
(25x0,46 cm, 5 m)
Áramló fázis:
0,025M TBAH-foszfát
pH: 6,0
(Optimálisan)
0,08M NaCl
NÉHÁNY FONTOSABB ANION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA
NÉHÁNY FONTOSABB KATION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA
21 TERMÉSZETES AMINOSAV ELVÁLASZTÁSA Dionex D-6A OSZLOPON
ANIONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL