Transcript Előadás7

Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium
Elválasztástechnika
kv1n1lv1
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fluoreszcenciás detektor – FLD
UV/VIS detektorhoz képest:
Érzékenyebb
Szelektívebb
(Csak fluoreszkáló komponensek detektálására
alkalmas)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fluoreszcenciás detektor – FLD
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fluoreszcenciás detektor – FLD
Az antracén gerjesztési és emissziós spektruma metanolban
Vibrációs alszintek
p
gerjesztés
Intenzitás
gerjesztés
h1
emisszió
excitation
225
275
Elválasztástechnika
325
375
Wavelength / nm
425
2011
*
h2
p
emisszió
475
Eke Zsuzsanna
Fluoreszcenciás detektor – FLD
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fluoreszcenciát befolyásoló tényezők
Szubsztituens
Hatása a em
Hatása az intenzitásra
alkil
nincs
Gyengén növeli vagy csökkenti
OH, OCH3, OC2H5
növeli
növeli
CO2H
növeli
Nagyon csökkenti
NH2, NHR, NR2
növeli
növeli
NO2, NO
--
Teljes kioltás
SH, halogen
növeli
csökkenti
SO3H
nincs
nincs
Fluoreszcenciát csökkentő tényezők:
Oldott oxigén vagy más szennyező
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fluoreszcens detektálást befolyásoló egyéb tényezők
A mérendő komponens koncentrációja;
Gerjesztési forrás intenzitása;
Besugárzott minta térfogata (cella térfogat);
A z emittált fényt elnyelő oldószer, vagy oldott anyagok
(koelució, szennyezések);
A szórt fény megnöveli a zajt (nagy molekulák, más
fényvisszaverő felület)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
20
60
40
0
0
5
10
Elválasztástechnika
15
20
2011
25
28.602 - Benz(a) pirén
80
30
33.361 - Indeno(1,2,3-cd) pirén
100
31.722 - Benzo(1,2,3-cd)perilén
255/420
27.440 - Benzo(k) fluorantén
LU
30.962 - Dibenz(a,h) antracén
277/376
25.244 - Benzo(b) fluorantén
24.164 - Benzo (e) pirén
230/330
20.624 - Krizén
18.922 - Benz(a) antracén
237/440
13.322 - Pirén
11.745 - Fluorantén
225/314 246/368
9.952 - Antracén
8.240 - Fenantrén
5.971 - 2-metil-naftalin
6.295 - 1-metil-naftalin
6.702 - Acenaftén
6.949 - Fluorén
4.823 - Naftalin
PAH-ok mérése HPLC-FLD-vel
Gerjesztési / emissziós
hullámhossz ex/em
FLD1 A, Ex=230, Em=330, TT (Y:\040128\002-0201.D)
230/400 250/495
Eke Zsuzsanna
min
Elektrokémiai (amperometriás) detektor-ECD
Olyan vegyületek detektálására alkalmazzuk, amelyek un. „elektroaktív”
csoportot tartalmaznak. Ezek a csoportok könnyen:
• Oxidálódhatók
• Redukálhatók
Szerkezet megvizsgálásával és egy ciklikus voltammogram
felvételével tervezhetővé válik.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Elektrokémiai (amperometriás) detektor-ECD
Előnyök:
Igen szelektív, igen érzékeny
Hátrányok:
Fémek jelenléte jelentősen zavarja (Fe, Ni, etc.).
Gradiens nem alkalmazható
Kis hőmérséklet- és áramlás- ingadozások is zavarják
= NEM ROBOSZTUS
Elválasztástechnika
2011
10
Eke Zsuzsanna
Elektrokémiai (amperometriás) detektor - ECD
Oxidálható
Fenolok
Oximok
Redukálható
Ketonok
Aldehidek
Merkaptánok
Peroxidok
Oximok
Konjugált
savak/észterek/nitrilek
Hidroperoxidok
Aromás aminok,
diaminok
Purin vázasok
Konjugált kettőskötés
Aktív halogén
Elválasztástechnika
Aromás halogén
Nitrovegyületek
2011
Eke Zsuzsanna
Radiokémiai detektor - RD
A mérendő komponens rádióaktivitása által kiváltott fény
emissziót méri (Heterogén – homogén szcintilláció)
Fő alkalmazási terület: metabolizmus kutatásban
Mérhető pl: 35S, 14C, 3H, 131I
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fényszórásos detektor – Evaporative Light Scattering Detector, ELSD
1. Porlasztás: Nitrogén gáz segítségével az oszlopot
elhagyó eluenst elporlasztjuk.
2. Mozgó fázis elpárologtatása: Egy fűtött csőben
áramoltatjuk át, ahol az oldószer elpárolog.
3.
Detektálás: A száraz minta részecskéket lézer
fénnyel világítjuk meg egy átfolyó cellában. A
részecskék által szórt fényt detektáljuk. A
detektált fény arányos a részecskék számával
(koncentrációjával).
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
ELSD
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Refraktív index (törésmutató) detektor – RID
Univerzális detektor, de csak akkor alkalmazható, ha az
elválasztott komponensek törésmutatója eltér az eluens
törésmutatójától;
Gradiens elúcióval nem kompatibilis (0,1% eluens összetétel
változás már a törésmutató változását idézheti elő);
Hőmérséklet változás (0,001C –ra termosztáljuk);
Pumpa pulzálás kontroll !!!!
Off-line eluens keverés
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
RID
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Izokratikus ill. gradiens elúció
mAU
IZOKRATIKUS
tR (min)
GRADIENS
mAU
tR (min)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Izokratikus ill. gradiens elúció
30% ACN
F
C
D
B
A
70% 20mM
E
Foszfát, pH=6.95
F
A
D
C
E
B
50% ACN
A: Feniletilamin
A
50% 20mM
F
B: Piridin
Foszfát, pH=6.95
C: 2-Picolin
F
80% ACN
20% 20mM
D+E
D: 2,4 Lutidin
E: 4-ethylpiridin
B+C
F: 2,3 dimetilanilin
A
Foszfát, pH=6.95
Az eluens erősség változása
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gradiens elúció
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gradiens elúció
Gradiens elúció problémák:
Egyensúly beállás idő;
Mozgófázis tisztasága („0” –lépésként oldószer
ellenőrzése);
Retenciós sorrend (szelektivitás) változása;
Oldószer probléma (k>10 vs. a minta oldása);
Detektor kompatibilitás (pl. RI detektor).
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gradiens elúció – nyomás profil
0,56ml/perc
75% AcN
Viszkozitás – összetétel
összefüggés
1 ml/perc
Kísérleti körülmények:
Purosphere C18, 5mm;
125*3mm, 25C
100% AcN
0,56ml/perc
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
MIP-Molecularly Imprinted Polimer
Célvegyület
Elrendeződés
Célvegyület
Polimerizáció (UV vagy T)
Monomerek
Extrakció
Célvegyület
- célvegyület
MIP
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
MIP-Molecularly Imprinted Polimer
MIP-alkalmazás
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Affinitás kromatográfia
Alkalmazások:
Immunaffinitás kromatográfiával az oszlopon megkötött
antitestekkel (antibodies) antigéneket tisztítunk;
Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálására;
Ellenanyaggal tisztíthatjuk azt a vegyületet, amely az
ellenanyagot termelte;
Immobilizált antitestekkel toxinokat kötnek meg vérből
(hemoperfúzió);
Szilárd fázisú immunoassay alkalmazásokban.
Az ipar biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális
antitestek ipari méretekben történő gyártására.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Affinitás kromatográfia
•Állófázis (mátrix)
90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz
származékok vagy egyéb polimer.
távtartó +
ligandum
+
+
+
+
+
+
+
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Affinitás kromatográfia
1. Kondicionálás
Puffer
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Affinitás kromatográfia
2. Mintafelvitel és mosás
Puffer
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Affinitás kromatográfia
2. Eluálás
Eluáló szer
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Affinitás kromatográfia
egyensúly
Minta megkötődése,
Minta eluálása
egyensúly
Abszorbancia mAU
egyéb komponensek eluálása
váltás elúciós
pufferre
mintafelvitel
1-2 ot.
x ot.
1-2 ot.
>1 ot.
1-2 ot.
Oszlop térfogat (ot)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Affinitás kromatográfia
Immobilizált fém affinitás kromatográfia
(immobilized metal affinity chromatography - IMAC)
a.
Immobilizáljuk a fémet kelát képző ligandumok segítségével;
b.
Különböző stabilitású komplexek képződnek a fém és olyan proteinek között,
amelyek elektron donor csoportot tartalmaznak (pl hisztidin, triptofán, cisztein
vagy foszfát csoport).
c.
A komplex stabilitása függ a ligandum, fém típusától, elektron donor csoport
sztérikus hozzáférhetőségétől, hőmérséklettől, pH és kompetitív donor
jelenlététől. Alkalmazott pH=6-8.
d.
Eluálás pH gradienssel vagy a glicin, hisztidin, hisztamin, cisztein
koncentrációjának növelésével (N és/vagy S tartalmú vegyületek, amelyek erős
elektron donorként leszorítják a proteint a fémről).
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
A GÉLKROMATOGRÁFIA
ELVÁLASZTÁSI
MECHANIZMUSÁNAK
SZTERIKUS
ELMÉLETI
MODELLJE
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
•102-108 Dalton méretű molekulák méret szerinti
elválasztása
Alkalmazások:
•Polimerek, polimer adalékok vizsgálata;
•Biopolimerek, peptidek, enzimek elválasztása;
•Molekulatömeg eloszlás, átlag molekulatömeg meghatározás;
•Minták tisztítása (peszticidek meghatározása élelmiszer mátrixból);
•A minta sómentesítése;
•Puffer csere.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
Gél szemcse
Pórusok (dp> 100A)
Állófázis
a kolonnában
Nincs kölcsönhatás a minta-
molekula és az állófázis között!!
Eltérő méretű molekulákból álló minta
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
Abs 265nm
„Fordított szita”
Idő (perc)
Eltérő méretű molekulákból álló minta
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
•Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél
nincs visszatartás (holt térfogat);
•Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van
visszatartás;
•Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek
teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans);
lgM
Teljes kizárási tartomány
Mérési tartomány
Teljes áteresztési tartomány
Elválasztástechnika
2011
V (ml)
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
Sómentesítés gélkromatográfiával
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
Antitest tisztaságvizsgálata gélkromatográfiával
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE
A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula
tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula
fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le:
4pN a
M

3 
3
RT
a
6pND
M – molekulatömeg,
N – Avogadro-féle szám,
a – Stokes-féle rádiusz,
D – diffuziós állandó,
υ – molekula fajlagos parciális térfogata,
η – viszkozitási együttható.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú
folyadékkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Ionpárképző reagens (Quaterner alkil ammónium só)
N+
Elválasztástechnika
-
Mérendő komponens ionos formája
C18 szilárd fázis
Ion-párképző só
[Molekula ION]
N+
2011
[Molekula ION]
-
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Ionpárképző reagens (Alkil szulfonsav só)
O
S
Ionpárképző só
[Molekula ION]+
O
Mérendő komponens ionos formája
C18 szilárd fázis
O
O
S
[Molekula ION]
O
+
O
Esetleg: CF3COO-; BF4-; ClO4-, PF6Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Na+
SO3-Na+
SO3-[ION]+
[ION]+
SO3-Na+
Ionpárképző mechanizmus (ioncserés modell)
Módosított állófázis
C18 szilárd fázis
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Az RP-IP_HPLC-ben változtatható paraméterek:
• Ionpárképző koncentrációja;
• Ionpárképző jellege (típusa, lánc hossza, stb.)
• Szerves modifikátor típusa, mennyisége;
• Puffer koncentrációja, pH-ja;
• Idegen só koncentrációja;
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – a szerves fázis
hatása
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ioncserés
folyadékkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ioncserés folyadékkromatográfia
Ioncsere: ha az állófázis állandó töltéssel rendelkezik;
Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes ion mennyiség
egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g);
„Ioncserélő gyanták”
A. Ionkizárásos kromatográfia
B. Ionkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ioncserélő töltetek
KATION CSERÉLŐK
Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, PO4-)
ANION CSERÉLŐK
Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino,
imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal
AMFOTER (kevert) TIPUSOK
Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex
szerkezettel
ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐK
DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkizárásos folyadékkromatográfia
Állófázis: nagy ioncserélő kapacitású anion vagy kation
cserélő gyanta;
Eluens: puffer (ritkán kis szerves oldószer tartalommal);
Alkalmazásai: fermentlevek, szeszesital, üdítőital gyártás
(cukrok, savak, alkoholok elválasztása)
HOOC-R
HO-R
Cukor
-
-
SO
-OOC-R
3
SO
3
pórus
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
A szervetlen anionok, kationok vagy vízben oldódó szerves
savak és bázisok meghatározására használjuk
Állófázis: kis ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő
gyanta;
Eluens: puffer;
Detektor: vezetőképesség (elektrokémiai) ionelnyomó után.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Hordozó
Üveggyöngy
ioncserélő
Jellemzők
Típus
Filmszerű
Gyors elválasztás, közepes
hatékonyság, kis kapacitás, pH 2-8,
(37-44 mm)
szárazon töltik, könnyen
bevonattal
Szilikagél alapú
beszennyeződik
Mikropórusos (10
Közepes gyorsaság,
nm)
leghatékonyabb,
pH 2-8, pépes töltés
Polisztirol
Elválasztástechnika
Mikropórusos
Lassú, kis hatékonyságú, jó
(10 nm)
kapacitás, pH 0-12, pépes töltés
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Visszatartást befolyásoló tényezők:
Növekvő pH
Nő a savak ionizációja – nő a visszatartás;
Csökken a bázikus vegyületek ionizációja – gyorsan
eluálódnak;
Puffer erősség nő
Ioncserélő felületeken megnő a versengés – csökken a
retenció;
Nő a hőmérséklet
Egyensúly kedvez a mozgó fázisnak – csökken a retenció.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Vezetőképesség mS
Szupresszió előtt
Szupresszió után
Elválasztástechnika
2011
Idő (min)
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Szupresszió ioncserés oszloppal (Regenerálni kell!!)
cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése (S/N növelése)
Cl- meghatározása
Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens NaHCO3):
Gyanta-H+ + Na+ HCO3 --> Gyanta-Na+ + H2CO3
Gyanta-H+ + Na+ Cl--> Gyanta-Na+ + HCl
A mozgófázis vezetőképessége jelentősen csökken, az elválasztott ion
vezetőképessége a Na ion (50 S*Cm2/equiv.) H ionnal (350 S*cm2/equiv.) történő
cseréjével jelentősen megnő.
Na+ meghatározása
Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens HCl):
Gyanta-OH- + H+ Cl- --> Gyanta-Cl- + H2O
Gyanta-OH- + Na+ Cl- --> Gyanta-Cl- + Na+ OHA mozgófázisból víz lesz, a mintában pedig lecseréljük a Cl- (76 S*cm2/equiv) ionokat
OH- ionokra (198 S*cm2/equiv).
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
2 - Kloridion / 3. 38
Alkalmazás (Anion referencia oldat); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3
IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop
7 - Szulfation / 8. 12
qc0205
100
6 - Foszfation / 7. 07
20
5 - Nitration / 5. 50
40
4 / 4. 80
60
3 - Nitrition / 3. 92
1 - Fluoridion / 2. 48
µS
80
0
0
5. 00
10. 00
Minutes
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Alkalmazás (vízminta); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3
100056
70. 0
4 - Szulfation / 8. 17
IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop
1 - Fluoridion / 2. 48
µS
40. 0
30. 0
20. 0
10. 0
3 - Nitration / 5. 58
50. 0
2 - Kloridion / 3. 38
60. 0
0
0
5. 00
10. 00
Minutes
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
21
TERMÉSZETES AMINOSAV
IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS
ELVÁLASZTÁSA
Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐN
(30X0,46 cm)
3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens
DETEKTÁLÁS:
NINHIDRIN
(post-column)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Hidrofób kölcsönhatású
kromatográfia
(Hidrophobic Interaction Chromatography,
HIC)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HIC vs. RPC
Mindkét technikában közös és jellemző:
- Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum.
- A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás.
- A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok
határozzák meg.
- Alkalmasak fehérjék elválasztására.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HIC vs. RPC
KÜLÖNBSÉGEK:
- A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja.
- A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában
(folded) marad, kisebb a denaturáció esélye.
- A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát
(unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób
jellege határozza meg.
- A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót
szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése
a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el.
Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye.
- A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis
(ligandum) felelős, a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a
domináns tényező
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Hidrofil kölcsönhatású
folyadékkromatográfia
(Hidrophilic Interaction Liquid Chromatography; HILIC)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HILIC
Állófázis: mint a normál fázisú kromatográfiában
Eluens: mint a fordított fázisú kromatográfiában 3-40% vízzel
(A víz az erős oldószer !!!)
Alkalmazásai: RP-hez túl poláros, nehezen visszatartható
komponensek elválasztására
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HILIC példa 1.
Fucose
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HILIC példa 2.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna