Transcript Előadás8

Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium
Elválasztástechnika
kv1n1lv1
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
SHS, SPME, SBSE
Szükséges-e az egyensúly?
A
t
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Származékképzés
Miért ? :
•Mérendő komponens illékonyságának növelése
•Mérendő komponens termikus stabilitásának növelése
•Retenciós tulajdonságok megváltoztatása
•Kimutatási határ csökkentése
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Folyadék kromatográfia
– HPLC
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
A kezdet
1903
Varsói Természettudományi
Társaság Biológiai Közleményei
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HPLC vs. GC
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HPLC vs. GC
Paraméter
GC
HPLC
Mérendő komponens
hőstabilitása
Az analízis általában
Elpárologtatás miatt kell szobahőmérséklet körül
megy
Mérendő komponens
molekulatömege
Jellemzően <700
Mintaelőkészítés
Szűrés kell, oldószer
Végén illékony oldószer legyen az eluenssel
elegyedő
Áramlás
Nyomás vezérelt
Áramlási sebesség
vezérelt
Mozgófázis szerepe a
szelektivitásban
Nem jellemző
Erősen befolyásol
Elválasztástechnika
2011
Csak az oldhatóság
jelent határt
Eke Zsuzsanna
A HPLC rendszer főbb részei
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Mozgó fázis gázmentesítése
He sparging, on-line vacuum degassing, refluxing,
vacuum filtration, ultrasonication
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Automata injektor
Pretreatment with automatic injection system:
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HPLC-s módszerek típusai
Mérendő
komponens
Módszer
Állófázis
Mozgófázis
Semleges,
gyenge sav,
gyenge bázis
Fordított fázisú
C18,C8,C4,
ciano, amino
Víz/szerves
Módosítók
Ionos, savas,
bázikus
Inpárképzés
C18, C8
Víz/szerves
ionpárképzők
Vízoldhatatlan
Normál fázisú
Szilika, ammino,
ciano, diol
Szerves
Szervetlen ionok
ioncsere
ioncserélő
Vizes puffer
Szilika
Gélszűrés – vizes
Gélpermeációszerves
Nagy
molekulatömegű
Elválasztástechnika
Méretkizárásos
2011
Eke Zsuzsanna
Oszlopgeometria
Preparativ oszlop
40-100 mm i.d.
Félpreparativ oszlop 20 mm i.d.
Félpreparativ oszlop 8 mm i.d.
Analitikai oszlopok 3,0;
4 vagy 4,6 mm i.d.
Mikro(bore)oszlopok
1 vagy 2 mm i.d.
Kapilláris oszlopok
20-800 mm i.d.
acél vagy PEEK
Elválasztástechnika
Gyors oszlopok
2,0- 4,6 mm i.d.
2011
Eke Zsuzsanna
Van Deemter egyenlet
B
2
H  Ad p   Cd p u
u
dp= 10 mm
H
dp= 5 mm
dp= 3mm
Nyomásesés a kolonnán:
fLu
Dp  2
dp
Dp- nyomásesés;
f- kolonna áramlási ellenállása;
- eluens viszkozitás;
L- kolonna hossz;
u (cm/sec)
dp- töltet átlagos szemcseméret
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
A folyadékkromatográfiás állófázisok - szervetlen
FÉMOXIDOK:
SiO2, Al2O3, CaO, MgO, BaO, TiO2, CeO2, ZrO2,
SÓK: SZILIKÁTOK,
Mg-Al szilikátok és egyéb összetett vegyületek
(Florisil, földpátok, bentonit, kaolin, síkpor, agyag)
KARBONÁTOK, SZULFÁTOK (Ca-Mg-karbonát, Ca-szulfát),
FOSZFÁTOK (Ca-, Zr-, HIDROXI APATIT)
NITRIDEK – BN
PORÓZUS ÜVEG SZEMCSÉK (Controlled Pore Glass, CPG 75-3000 μm)
CPG GLYCOPHASE (gliceropropilszilán réteggel)
SZERVETLEN (SZILIKA) – SZERVES (POLIMEREK) KEVERT TÍPUSOK
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
A folyadékkromatográfiás állófázisok - szerves
SZÉN (aktív C, porózus grafitált karbon, PGC)
POLISZACCHARIDOK (cellulóz, keményítő, porcukor)
DEXTRÁN (keresztkötésekkel térhálósított gélek, Sephadex)
AGARÓZ (agar-agar, agaropektin)
POLIAMID
POLIAKRILAMID (akrilamid - metilén bis-akrilamid kopolimer)
POLIETILÉN IMINEK
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Szilika alapú állófázisok
Spherical
Silica Sols
Irregular
Xerogels
Particles are 3-10 mm in
diameter for standard columns.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ismétlés vége
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Monolit oszlopok
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Folyadékkromatográfiás állófázisokról
ALAK-FORMA
IRREGULÁRIS – TÖRMELÉK SZEMCSÉK (POROK)
GÖMBSZIMMETRIKUS – SZFEROID SZEMCSÉK
SZEMCSEMÉRET
ELOSZLÁS - HATÁROK
>1 mm
GAUSSI, vagy ASZIMMETRIKUS ELOSZLÁS,
HOMODISZPERZ - HETERO(POLI)-DISZPERZ
SZERKEZET
HOMOGÉN (TÖMÖR) SZEMCSÉK
ADHÉZIÓVAL, vagy KÉMIAILAG KÖTÖTT FELÜLETI RÉTEGEK
PORÓZUS (PELLICULÁRIS) FELÜLETI RÉTEGEK
TÁGPÓRUSÚ (PORÓZUS, PERFUZÍV) TÖLTETEK
TÖMBPOLIMER (MONOLIT) OSZLOPOK …
HALMAZ ÁLLAPOT
STABILITÁS
Elválasztástechnika
SZILÁRD (rigid, xerogél) – GÉL (liogél) – FOLYADÉK
NYOMÁS, HŐ, pH, OLDÉKONYSÁG, BAKTERIÁLIS, KÉMIAI
2011
Eke Zsuzsanna
Állófázisokkal szemben támasztott követelmények
• Stabilitás
(nyomás, hő, pH, oldékonyság, bakteriális, kémiai…)
• Minél kisebb és homogénebb szemcseátmérő
(hatékonyság és nyomásesés)
• Energetikai homogenitás
(visszatartásért felelős helyek homogén eloszlása);
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Állófázisok jellemzése
Állófázisok jellemzése:
Ideális eloszlás
Az átlagos pórus átmérő
A fajlagos felület
A fajlagos pórustérfogat
Pórus átmérő
gyakoriság
(%)
Ne legyen pórusgátlás
(Feltétele
hogy a molekula mérete egy
nagyságrenddel kisebb legyen mint
pórusátmérő)
Ideális eset
Későn jön ki (tailing)
Elválasztástechnika
Beszorul (tailing)
dp átlag
2011
dp (nm)
Eke Zsuzsanna
A szilikagél szerkezete
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
A szilikagél felülete
Szilikagél határfelülete (pH = 2 – 8)
Határfelületen nem
OH
OH
OH
OH
disszociált szilanol
csoportok
O
Si
O
Si
Si
O
O
Si
O
Szilárd fázis
O
O
O
O
Szerkezetéről kevés a megbízható információ (a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag
nem stabil forma - stabil forma a kristályos szerkezet „kvarc”)
H
Vicinális szilanol
csoportok
Izolált szilanol
csoportok
H
H
O
Dezaktivált szilanol
csoportok
H
H H
OH
OH
O
O
O
O
Si
Si
Si
Si
Si
Si
O
O
O
O
O
O
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fémszennyezések hatása
Legproblémásabb szennyezők: Fe(III), Al (III)
Problémák:
•Kelát képzés
•Reaktív/savanyúbb szilanol csoportok
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fémszennyezések hatása
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Módosított szilika állófázisok
Távtartó
Árnyékoló
Kölcsönható
CH3
Si
O
Si
CH2
CH2
CH2
CN
NH2
NO2
CH(OH)-CH2(OH)
CH3
C18
…..
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Módosított szilika állófázisok
NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT FÁZISOK (RP)
- OH (diol)
- C2, -C4, -C8, -C18
- CN (ciano)
- C6H5 (fenil)
- NO2 (nitro)
- etil,
- NH2 (amino)
- i-propil
- N(CH3)2 (dimetil amino)
- i-butil
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Módosított szilika állófázisok
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Módosított szilika állófázisok
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Módosított szilika állófázisok
Classic ODS
Sterically Protected
(non-endcapped)
Conventional
Conventional
(endcapped)
(non-endcapped)
H
H
H
* Savasan hidrolizálhat
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Normál fázisú
folyadékkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)
NP: Az álló fázis polárisabb, mint a mozgó fázis
Mikor alkalmazzuk?
Apoláris vagy kevésbé poláris vegyületek meghatározására;
Hexán oldható vegyületek;
Helyzeti izomerek elválasztására.
Állófázisok
Szilikagél (40-50%);
Alumínium-oxid (3-10%);
Királis állófázis (20-25%);
Módosított szilikagél (pl. NH2, CN, NO2, diol stb.).
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)
Komponens adszorpcióját befolyásoló tényező
(minél nagyobb a kötödés, annál nagyobb a visszatartás):
a vegyület leszorítja az oldószer molekulákat a szilárd fázis felületéről;
Oldószer víztartalma (H-hidas kötésekkel megakadályozza a vegyületek
megkötődését, víztelenítés vízmentes különböző polaritású oldószerekkel
vagy N2-el szárítás 150C-on;
Pórusok átmérője;
Szilanol csoportok típusa;
Fémszennyezők jelenléte (polarizálja a szilanol csoportot), a harmadik
generációs szilikagélekre a fémtartalom < ppm).
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Normál fázisú folyadékkromatográfia
Aluminium-oxid (pH = 2 – 12 )
Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt (általában bázikus vegyületeknél);
Gyengébb adszorpciós kölcsönhatást mutat;
Olyan vegyületek vizsgálatára, amelyek savkatalízisre bomlanak;
H
Alakszelektivitást szeretnénk elérni;
általában
Szilikagéltől eltérő szelektivitás.
Módosított szilikagél (pH = 2 – 8 )
Al2O3
•Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt;
•Víz dezaktiváló hatás csökkentése;
Mert jobb a pórusszerkezet
u (cm/sec)
•Szelektivitás növelése;
•A mozgófázis polaritásától függően lehetnek fordított fázisú töltetek!!!
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)
Mozgófázisok (eluens)
Apolárisabb az állófázisnál
Oldja a mintát és ne reagáljon a minta komponensekkel
Detektor kompatibilitás
Megfelelő tisztaságú (szilárd szennyezők, O2 mentes stb.)
Alacsony viszkozitású ( < 1 cP 25C-on)
Könnyen beszerezhető, elfogadható áron
Biztonságos (CCl4 benzol stb. egészségre káros)
Könnyen keveredő
Forrpont (nem túl alacsony buborékképződés miatt)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)
Alap oldószerek:
Oldhatóság, polaritás
növelő oldószerek:
Hexán
Heptán
Izooktán
Diklórmetán
Diklóretán
Kloroform (stabilizálás etanollal !!!)
Modifikátorok:
Módosító szerek az állófázis felületét megváltoztatják (csökkentik a retenciót);
Fém szennyeződések maszkírozására ecetsavat
Vizet és aminokat nem használunk – irreverzibilisen kötődnek
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú
folyadékkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP)
RP: az álló fázis apolárisabb mint a mozgó fázis
A leggyakrabban alkalmazott folyadékkromatográfiás
módszer (elválasztások 80%-a);
Állófázisok
Szilikagél alapú; (80-90%) (pH = 28);
Szerves polimer alapú; (5-10%) (pH = 114);
Egyéb (szén alapú, zeolit, alumínium-oxid alapú stb.; 2-10%)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú folyadékkromatográfia
Szerves polimer alapú állófázisok
-A teljes pH tartományban alkalmazhatóak;
-Térhálós szerkezetűknek tulajdoníthatóan nagy mechanikai stabilitással rendelkeznek;
-Mikropórusok képződése elkerülhetetlen, így kinetikai hatékonyságuk kisebb mint a szilikagél alapú
állófázisoké.
H
C CH2
HC CH2
HC CH2
H
C CH2
+
C CH2
H
C C
H H2
Sztirol Divinil-benzol
Elválasztástechnika
Kopolimer
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú folyadékkromatográfia
Szerves polimer alapú állófázisok
-A szerves polimert oldó oldószerek (klórozottak) duzzasztják a polimert, ettől összeroppan
-Apoláris jelleg csökkentésére módosítják a polimert (pl. szulfonil, piridin stb.)
H
C CH2
H
C
C
H2
H
H
C CH2 C
N
SO3H
Polaritást növelő módosítások
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok
Eluenserősség
Elúciós erő
Víz< Metanol<Acetonitril<Etanol<Izopropanol<Tetrahidrofurán
Szelektivitás
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Az eluensek legfőbb tulajdonságai
Tisztaság
Viszkozitás
Refraktív index
Forráspont
Toxicitás
UV-Cutoff
Oldhatóság/elegyíthetőség/oldóképesség
Elválasztástechnika
2011
42
Eke Zsuzsanna
Solvent Miscibility
Name
Acetic Acid
Acetone
Acetonitrile
Benzene
Butyl Alcohol
Carbon Tetrachloride
Chloroform
Cyclohexane
Cyclopentane
Dichloroethane
Dichloromethane
Dimethylformamide
Dimethyl Sulfoxide
Dioxan
Ethylacetate
Ethyl Alcohol
Di-Ethylether
Heptane
Hexane
Methyl Alcohol
Methylethyl Ketone
I-Octane
Pentane
I-Propyl Alcohol
Di-Propylether
Tetrachloroethane
Tetrahydrofuran
Toluene
Trichloroethane
Water
Xylene
Elválasztástechnika
Immiscible
Miscible
2-Propanol is an excellent
intermediate solvent
2011
43
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú folyadékkromatográfia
A pH szerepe az RP-HPLC-ben
Semleges
A pH nem befolyásolja a molekula állapotát, ezért NINCS szükség
a pH ellenőrzésére.
Semleges vegyületek:
•Polikondenzált aromások;
•Halogénezett aromás vegyületek;
•Alkoholok;
•Éterek;
•Ketonok;
•Aldehidek
•Stb.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú folyadékkromatográfia
A pH szerepe az RP-HPLC-ben
Savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek
A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH
ellenőrzése.
R-COOH

R-COO-
Nemionizált forma (apolárisabb)

R  COOH
Ka  105
pKa  5
H+
Ionizált forma (polárisabb-vízoldható)

R  COO H 
Ka 

+
LeChatelier elv
HA
pH  pKa  5 ; 50% ionizált
HA
pH  4 ; 10% ionizált
HA
HA
pH  3 ; 1% ionizált
pH  6 ; 90% ionizált
Sosem kromatografálunk pH = pKa értéken !!!
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú folyadékkromatográfia
A pH szerepe az RP-HPLC-ben
pKa
pKa+2
Robusztus
!!! pH=2
pKa-2
Robusztus !!! K’
k
!!! pH=8
pH
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú folyadékkromatográfia
A pH szerepe az RP-HPLC-ben
Bázikus jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek
A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH ellenőrzése.
R-NH2 + H+ 
R-NH3+
Nemionizált forma
(apolárisabb)
Ionizált forma (polárisabb-vízoldható)
k
pKb
pKb+2
Robusztus !!! K’
Robusztus
!!! pH=2
pKb-2
!!! pH=8
pH
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú folyadékkromatográfia
A pH szerepe az RP-HPLC-ben
pH kontroll pufferek segítségével történik
(csak szükség esetén használjuk, mert csökkentik az állófázis élettartamát!)
Puffer koncentrációja (2mM-0,2M tartományban)
Gyakran használt pufferek:
Foszfát
Citrát
Trisz(hidroximetil)-aminometán
Acetát
Formiát
Stb.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú folyadékkromatográfia
A pH szerepe az RP-HPLC-ben
Pufferekkel szemben támasztott követelmények:
A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz;
Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!);
Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése;
Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves
oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb);
A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben;
Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel);
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Solvent Handling
Solvent Characteristics
(Specifications):
Purity
Viscosity
Refractive index
Boiling Point
Toxicity
UV Transparency/UV-Cutoff
Solubility
Elválasztástechnika
2011
51
Eke Zsuzsanna
Solvent Miscibility
Name
Acetic Acid
Acetone
Acetonitrile
Benzene
Butyl Alcohol
Carbon Tetrachloride
Chloroform
Cyclohexane
Cyclopentane
Dichloroethane
Dichloromethane
Dimethylformamide
Dimethyl Sulfoxide
Dioxan
Ethylacetate
Ethyl Alcohol
Di-Ethylether
Heptane
Hexane
Methyl Alcohol
Methylethyl Ketone
I-Octane
Pentane
I-Propyl Alcohol
Di-Propylether
Tetrachloroethane
Tetrahydrofuran
Toluene
Trichloroethane
Water
Xylene
Elválasztástechnika
Immiscible
Miscible
2-Propanol is an excellent
intermediate solvent
2011
52
Eke Zsuzsanna
Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Praktikus tanácsok a HPLC-s oszlopokkal kapcsolatban
 Avoid any physical stress to the column
 Close on both ends to avoid dryness
 Store the column well flushed with
the appropriate solvent
 Record the history of the column
Elválasztástechnika
2011
54
Eke Zsuzsanna
Column Installation
Each column has a defined flow direction!
The flow direction is shown by the arrow or direction of writing.
Don’t change the flow direction, this will decrease column performance.
Elválasztástechnika
2011
55
Eke Zsuzsanna
Column Equilibration
Equilibrate with mobile phase
•
Do not pressure shock the column.
•
5-10 column volumes for reversed-phase equilibration.
• Assures reproducible results.
Elválasztástechnika
2011
56
Eke Zsuzsanna
Column Care and Handling
Wash the column after use with selected solvents; flush highly retained
sample components from the column.
Do not store a column in 100% water. Microbes may grow and clog the
column.
Don’t open the column and repack the material if you want to maintain
performance.
Use the column at its optimal flow rate - avoid high flow rates.
Do not operate silica or bonded phases for extended periods at high
temperature.
Keep the pH of the mobile phase in an appropriate range for the column.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna