Transcript Kromatográfia CE alt

Kapilláris elektroforézis
Definíciók
• Az elektroforézisnél az oszlop (réteg) két végére
elektródokon keresztül feszültség van kapcsolva.
• Az oldatban lévő ionok a feszültség hatására
elmozdulnak az ellentétes pólusú elektród felé.
• Az ionok töltésüktől és „méretüktől” függő
sebességgel mozognak (migrálnak).
• Az elektroforézis alapjaiban nem kromatográfia,
mert nincs megoszlás két fázis között.
• A minőségi jellemző a migrációs idő (tm)
• Mennyiségi jellemző a csúcsterület (A)
Ion sebesség és mobilitás
Az ionok sebessége arányos a feszültséggel.
Elektroforetikus mozgékonyság
függése töltéstől és a súrlódástól
Kromatográfiás módok összehasonlítása
Különböző kölcsönhatási erők szerepe
egyes kromatográfiás módokban
Ideális kromatográfiás
Módok egyes anyagokra
GC
Könnyenilló, hőstabil vegyületek
HPLC
Poláros, nehezen illó,
hőre bomló vegyületek
EKC
Ionos vegyületek
A gázkromatográfia túlnyomórészt (70-95%)
Forrpont szerinti szelektivitást mutat.
Klasszikus gél elektroforézis
A feszültség 1-2 kV.
Magasabb feszültségnél az oldat felforr a Joule hő miatt.
Analízisek több óráig tartanak.
Western blots módszer
Kapilláriselektroforézis készülék diagramja
Oszlop: kvarc, 15-70 cm x 0,02-0,075 mm.
A teljes és az effektív oszlophossz
Agilent CE instrument
Kapilláris előnyei az
elektroforézisben
• Nagy hőleadás → nagyfeszültségesés →
gyors analízisek → nagy hatékonyság
• U alakú áramlásprofil
• On-column detektálás
• Kevés puffer és minta szükséglet
• Csekély mintaelőkésztés igény az
analízisek közötti gyors, hatékony oszlop
regenerálás (0,1 N NaOH) miatt
• Egyszerű kezelés
A kapilláris kis átmérőjének előnye
• A puffer tömegéhez képest nagy a kapilláris
felülete, ezért intenzív a hőleadás.
• A nagy hőleadás megakadályozza azt, hogy a
molekulák pufferben való áramlásakor keletkező
súrlódási Joule hő felforralja a puffer.
• A nagy sebesség eléréséhez nagy feszültséget
(30kV) lehet alkalmazni.
• A nagy sebesség gyors analíziseket
eredményez.
• A nagy sebesség nagy hatékonyságot (100 0001000000 tp) biztosít
Nyomelemzések CE-vel
A nagy hatékonyság lehetővé teszi több nagyságrenddel
különböző csúcsok egymás melletti meghatározását.
CE csekély a mintaszükséglete
Mátrix komponensek két analízis között kimoshatók
erős vegyszerekkel.
Gyors analízisek
A rövid oszlophossz és a pufferben oldott reagens
teszi lehetővé a nagy sebességet.
Gyors analízisek
Injektálás a rövidebb
detektorhoz közeli végén
(fordított polaritás).
Az elválasztás 15 cm
úthosszon történik.
Az elektroozmotikus áramlás
kialakulása (EOF) kvarc kapillárisban
A töltéssel elrendeződés és a zeta
potenciál kvarc kapillárisnál
A kvarc kapilláris felületén lévő szilanol negatív
töltéssel rendelkeznek pH 3 fölött.
Az EOF áramlás profilja
Az EOF áramlásprofilja laposabb mint a laminárisé,
ezért a minta keskenyebb tartományba oszlik el,
azaz nagyobb a hatékonysága.
EOF csökkentése és átfordulása pozitív
töltésű detergenek hatására
Az EOF
poliakrilamid
vagy teflon
borítással is
megszüntethető.
Rendszerint az EOF nagyobb az
ionok saját migrációs sebességénél
A nagysebességű EOF miatt az anionok is a
katód felé áramlanak.
A tényleges és a látszólagos
mozgékonyság
Az EOF egyenlete
Az EOF függése puffer
koncentrációjától és
az ionerősségtől
Az EOF függése a pH-tól és a
függés hiszterézise
Az egyensúlyi szilanol
koncentráció beállása
időigényes folyamat.
A gyakorlatban nem
várják meg az egyensúly
beálltát, hanem két
analízis között lúggal
mossák a kapillárist,
ezért az EOF értéke
reprodukálható.
A különböző kapilláris
elektroforézises módszerek
Zonális
Elektroforézis
Izoelektromos
fókuszálás
Izotahoforézis.
A különböző kapilláris
elektroforézises módszerek
• Zonális elektroforézis: A különböző anyagok
eltérő sebességgel haladnak töltésük és
méretük szerint.
• Izoelektromos fokuszálás: A kapillárison pH
gradiens van. Az ampholitok (pozitív és negatív
töltéssel is rendelkezetnek) az izoelektromos
(semleges) pontjuknak megfelelő helyen
koncetrálódnak, és nem vándorolnak tovább.
• Kapilláris izotachoforézis: A vizsgált anyagok
vezető és záró elektrolit között foglanak helyet
vezetőképességűk sorrendjében, és egyforma
sebességgel haladnak.
Zónás kapilláris elektroforézis
Zónás kapilláris elektroforézis
Az ionok sebessége függ
• A töltésüktől
• Töltésük polaritásától
• A méretüktől (hidrátburokkal együtt),
alakjuktól
• A feszültségtől
• Az EOF-től
• A puffer viszkozitástól
Micelláris elektrokinetikus
kromatográfia
Micelláris elektrokinetikus
kromatográfia
A minta megoszlik a micellák és a háttér
puffer között.
A micellákba zárt minta migrációs
sebessége eltér a háttér pufferben lévő
molekulák sebességétől
A töltéssel rendelkező micellákkal semleges
molekulákat is el lehet választani
A kapilláris elektroforézis
alkalmazásai