Transcript A DNS Szekvenálás_2008_MarosGergely

A DNS Szekvenálás
2008
Géntechnikák labor
Bevezetés
•
•
•
•
Restrikciós enzimek / restrikciós térképek
Genom könyvtárak
Fehérje aminosavsorrend meghatározás
Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása,
vakcinarezisztens mutánsok)
• Direkt szekvenálás
– Egyféle termék
• Klónozott PCR termék
– Többféle termék
– Egymásra rakódó szekvenciák
– Klónozás plazmidba
Módszerek
• Maxam-Gilbert-féle kémiai degradáció
–
–
–
–
5’ radioaktív izotópos jelölés (32P)
Bázis specifikus hasító reakciók
Elektroforézis, autoradiogramm
Mérgező anyagok, négy reakció
• Sanger-féle enzimatikus módszer
– Automatizálható!!!!!
– Az eljárás közben nő a DNS mennyisége, tehát kisebb
mennyiségű is kimutatható
– Egy reakcióban is megoldható
– Fluoreszcens molekulával jelölt primer, vagy didezoxinukleotidok
– PCR + Elektroforézis poliakrilamid gélben
A reakcióelegy:
•
•
•
•
Templát
Oligonukleotid primer
DNS polimeráz
Dezoxinukleotidok (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)
O O
O P
O O
O P
O
O
N
O
O O
O P
O
N
N
N
N
N
N
O
N
O
O
O
N
O
O
N
O
O
O
O O
O P
N
N
N
O
N
O
O
N
• Didezoxinukleotidok (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)
O
O O
O P
O
O P
O
N
O
N
N
N
N
O O
O P
O
O
O
N
N
N
O
O O
O P
O
N
O
O
N
N
N
N
O
O
N
N
O
A szekvenálás
• Denaturáció
• Anelláció
– Egy primer
• Elongáció
– Véletlenszerű lánc termináció
A szekvenálás menete
O
O O
O P
O
O
O P
O
N
N
O
O
N
N
O
N
N
N
N
O
O
N
N
O O
O P
O
O
N
N
N
O
N
N
O
O P
O
O
O
N
N
N
O
O O
O P
O
O
O
N
N
N
O O
O P
O
O
O
N
N
O
O
Elválasztás
• Elektroforézis kapillárisban (375μm / 75μm)
– Nagy felület-térfogat arány → nagy hőleadóképesség
→ nagyobb feszültségnél sem melegszik annyira
– Kis feszültség: szebb elválasztás
• Poliakrilamid mátrix
– Betöltés: nagynyomású nitrogén
– nagy felbontás
• Minta bejuttatása
– Elektrokinetikus injektálás
– Megfelelő neg. Ionok (DNS) legyenek csak!
– Ha eltömődik a kapilláris, leesik az áramerősség
Detektálás
• A jelölő molekulát lézerrel gerjesztjük, majd
mérjük a fluoreszcenciát
• Fluoreszcensen jelölt primer
– Négy reakció
– Mindegyikben csak egy didezoxinukleotid
– Négy futtatás
• Fluoreszcensen jelölt didezoxinukleotidok
– Egy reakció
– Egy futtatás
– Minden ddNTP más hullámhosszon detektálható
Kiértékelés
• A jelekből egy szoftver kromatogrammot készít,
a bázisokat eltérő színű csúcsok jelölik.
– Szekvencia ellenőrzés!!!!!
• Olvashatatlannak ítélt pozíciók N betűi
• Kiértékelési hibák
• Kimaradt betűk
Szekvenciák összehasonlítása
• Fontos mindkét szálat megszekvenálni, és
összehasonlítani az eredményeket.
• Összehasonlításhoz ingyenes internetes
szoftverek. (Clustal, Multalin)
TTV típusok genomjának összehasonlítása (Multalin)
Irodalomjegyzék
• Berencsi György: Orvosi molekuláris virológia
• Multalin ( http://ribosome.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html )
Köszönöm a figyelmet!