Transcript Ioncserélő folyadékkromatográfia.

ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK
ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA
Dr. Kremmer Tibor
V.
FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM
Budapest – 2013
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS
Ószövetség (Exodus xv. 23-5) víz tisztítás
Arisztotelész (cit. Hellferich, 1959) tengervíz sótlanítás
Bacon (XVII. sz. eleje) alkimia, gyógyszerészet, derítés-perkolálás
Thompson (1850), Way (1852) kationok adszorpciója agyagon
Eichorn (1858), Boedecker (1859)
egyensúlyi folyamatokra empirikus egyenletek
Harms (1896) cukorgyártásban szabadalom
Harms és Rümpler (1903) szervetlen szintetikus ioncserélők
Gans (1905) Al-szilikátok alkalmazása vízlágyításra
Fischer és Hoffmeister (1910-20) Kuhn, Lederer és Winterstein
(1932-35) fehérje kémiai alkalmazások, tisztítás
elválasztás
Adams és Holmes (1935- ) polimerkémia, szerves ioncserélők,
PDB műgyanták, bakelit (hanglemez !)
IONCSERÉLŐ
FOLYADÉK
KROMATOGRÁFIA
Ion Exchange Chromatography
(IEX)
WAX – SAX
(weak – strong)
WCX - SCX
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK)
ÖSSZETEVŐK IONOS, vagy IONIZÁLHATÓ TULAJDONSÁGA
FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK TÖLTÉSE ÉS MINŐSÉGE
IZOELEKTROMOS PONT (makromolekula, biopolimer)
A TÖLTÉS VISZONYOK (net charge) VÁLTOZÁSA
A pH ÉS IONERŐSSÉG HATÁSÁRA
MOLEKULA TÖMEG ÉS SZERKEZET
DETEKTÁLHATÓSÁG
BIOLÓGIAI AKTIVITÁS
OLDÉKONYSÁG
STABILITÁS
FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK
IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ÁLLÓ FÁZIS – IONCSERÉLŐ TÖLTETEK
TENTACLES
KATION CSERÉLŐK
GYENGE - ERŐS
ANION CSERÉLŐK
~~N+H2 < ~~N+HR < ~~N+R2 < ~~N+R3
erősen szubsztituens (R) függő
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
IONCSERÉLŐ TÖLTETEK
KATION CSERÉLŐK
Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, CM, PO4)
ANION CSERÉLŐK
Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner
amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal
AMFOTER (kevert) TIPUSOK
Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex
szerkezettel
IONCSERÉLŐK
ERŐS - GYENGE
DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT
„TENTACLE” ELV - KAPACITÁS !
ROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
Elnevezés
Összetétel (matrix)
Gyártó - Forgalmazó
Dowex A (WBA)
C 88
Sztirol divinil benzol
SIGMA
Amberlit IR
Sztirol divinil benzol
SERVA
Sepharose Q, DEAE,
ANX, SP, CM,
BioBeads MonoQ
MonoP, MonoS
Fractogel EMD
DEAE 650
TMAE 650
SO3- 650
Dextrán-agaróz
kopolimer
Pharmacia-LKB
Polivinil sztirol
kopolimer
Pharmacia-LKB
AG MP, 50W, X4
Poli metilmetakrilát
Sztirol divinil benzol
Akrilát
Poliamin
Merck, Darmstadt
BioRad Laboratories
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS
A LEGFONTOSABB MODULÁLÓ TÉNYEZŐK
KÉMHATÁS - pH - PUFFEREK
AZ IONCSERE EGYENSÚLYI FÁZISÁBAN
A MEGFELELŐ ELLENION ÉS AZ
IONCSERÉLŐ TÖLTÉSÉNEK BIZTOSÍTÁSA
AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) TÖLTÉSÉNEK
KIALAKÍTÁSA (pozitív, vagy negatív, pl. fehérjék)
AZ IONCSERE pH-val MODULÁLT ELÚCIÓS FÁZISÁBAN
AZ ELVÁLASZTANDÓ VEGYÜLETEK
ÉS AZ IONCSERÉLŐ
IONOS KÖLCSÖNHATÁSAINAK
SZELEKTÍV MEGVÁLTOZTATÁSA
A kationcserélő kromatográfiában használt pufferek
Puffer
pKa
pH tartomány
Foszfát
2,12
7,21
12,32
1,1-3,1
6,7-7,6
11,8-12
Citrát
3,06
4,74
6,40
2,4-3,4
3,7-5,7
4,4-6,4
Formiát
3,75
3,8-4,3
Szukcinát
4,20
4,3-4,8
Acetát
4,75
4,8-5,2
N-Metil piperazin
4,75
4,5-5,0
Malonát
5,69
5,0-6,0
2-(N-morfolino)etán szulfonsav (MES)
6,15
5,5-6,7
N-(2-acetamido) iminodiecetsav (ADA)
6,62
5,8-6,9
Piperazin-1,4 bis (2-etán szulfonsav) (PIPES)
6,80
5,9-7,1
(1,3-Bis tris-(hidroximetil) metilamino propán (Bis-tris-propán)
6,80
6,4-7,3
3-(N-morfolino) propánszulfonsav (MOPS)
7,20
6,5-7,5
HEPES
7,55
7,6-8,2
Borát
9,35
8,2-10,2
Glicilglicin
3,14
8,25
Az anioncserélő kromatográfiában használt pufferek (klorid, ill. K-Na só)
Puffer
pKa
pH tartomány
Bis tris-(hidroximetilamino) metán
6,50
5,8-6,4
(1,3-Bis tris-(hidroximetil) metilamino propán (Bis-tris-propán)
6,80
6,4-7,3
Trietanolamin
7,80
7,3-7,7
Tris-hidroximetilamino metán
8,16
7,6-8,0
N-Metil dietanolamin
8,54
8,0-8,5
Dietanolamin
8,90
8,4-8,8
1,3 Diaminopropán
8,54
10,47
8,5-9,0
9,8-10,3
Etanolamin
9,50
9,0-9,5
2-(Ciklohexilamino) etánszulfonsav (CHES)
9,50
8,9-10,2
3-(Ciklohexilamino) propánszulfonsav
(CAPS)
10,40
9,7-10,6
Foszfát
12,3
11,08-12,0
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS
IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG
1
2
I   ci  zi
2
összefüggésből számítható, ahol:
ci
z i2
az i-edik ion koncentrációja,
az i-edik ion töltés számának négyzete.
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS
POLARITÁS
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS POLARITÁSÁNAK VÁLTOZTATÁSA
(CSÖKKENTÉSE) ADALÉK OLDÓSZEREKKEL
METANOL, ACETONITRIL
AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK ERŐSSÉGÉNEK
VÁLTOZTATÁSA
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
MUNKAFOLYAMATAI
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
EGYENSÚLYI ÁLLAPOT BEÁLLÍTÁSA
(EKVILIBRÁLÁS)
AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAGOK KÖTŐDÉSÉRE
AZ EGYÉB (KONTAMINÁNS) ANYAGOK ELKÜLÖNÍTÉSÉRE
A MEGFELELŐ ÁLLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK OPTIMÁLÁSA
pH, IONERŐSSÉG-MINŐSÉG, POLARITÁS
KEMOSZORPCIÓ
AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN OLDOTT MINTA
KÖLCSÖNHATÁSBA HOZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL
AZ EGYÉB (NEM KÖTŐDŐ) ANYAGOK LEOLDÁSA AZ
ÁRAMLÓ FÁZISSAL
(ELÚCIÓ)
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
A DESZORPCIÓ MŰVELETEI
(ELVÁLASZTÁS, FRAKCIONÁLÁS)
AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK SZELEKTÍV MEGBONTÁSA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK
pH, IONERŐSSÉG, POLARITÁS
SZISZTEMATIKUS
SZAKASZOS és/vagy FOLYAMATOS, EGYIDEJŰ vagy KÜLÖNÁLLÓ
VÁLTOZTATÁSÁVAL
IZOKRATIKUS ELUCIÓ
GRADIENS ELUCIÓ
AZ ELUENS PARAMÉTEREINEK VÁLTOZTATÁSA
SZAKASZOS - LÉPCSŐZETES
LINEÁRIS, vagy EGYÉB
(KONVEX, KONKÁV, stb.) FÜGGVÉNYKAPCSOLAT SZERINT
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
GRADIENS KÉPZÉS
(pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS)
pH
B > A
B
A
V
Jel
(AU)
I
pH
A
B
C
D
V0 (t0)
Elúciós térfogat (idő)
A GRADIENS ELÚCIÓ ÉS FÜGGVÉNYKAPCSOLATAI
Jel
(AU)
I
pH
X
Y
A-gradiens
YAB
XAB
B-gradiens
Elúciós térfogat (idő)
Példa a gradiens elúció hatására
21
TERMÉSZETES
AMINOSAV
IONCSERÉLŐ
KROMATOGRÁFIÁS
ELVÁLASZTÁSA
Dionex DC-6A
ANIONCSERÉLŐ
OSZLOPON
(30X0,46 cm)
3 LÉPÉSES
Na-citrát gradiens
PROGRAMMAL
DETEKTÁLÁS:
NINHIDRIN
(post-column)
TERMÉSZETES AMINOSAVAK FMOC SZÁRMAZÉKAINAK
ELVÁLASZTÁSA IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL
FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK
IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI
CELLULÁZ TRIPSZINES EMÉSZTÉSI TERMÉKEINEK ELVÁLASZTÁSA
ANIONCSERÉLŐ (Mono Q) KROMATOGRÁFIÁVAL
KÍGYÓMÉREG ÖSSZETEVŐINEK ELVÁLASZTÁSA KATIONCSERÉLŐ
FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
HbA1C ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE KATIONCSERÉLŐ (Mono S)
KROMATOGRÁFIÁVAL
HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA
HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL
LAKTÁT DEHIDROGENÁZ (LDH) IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA
KATION CSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
VIZELET FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA ANIONCSERÉLŐ (Mono Q)
KROMATOGRÁFIÁVAL
- LIGHT CHAINS FEHÉRJE KIMUTATÁSA KÓROS VIZELETBEN
(MYELOMA MULTIPLEX)
AU280
B%
100
AGP
HSA
50
Globulinok
Idő (perc)
Humán szérumból folyadék-folyadék fázisú extrakcióval nyert vizes-metanolos fázis
savanyú alfa-1-glikoprotein (AGP) tartalmának elválasztása és tisztítása ioncserélő
folyadékkromatográfiával Fractogel EMD TMAE 500M oszlopon (5X0.5 cm) gradiens elúcióval
(A-puffer: 5 mM NaH2PO4 pH: 6.5, B-puffer: 350 mM NaCl A-pufferben).
Szaggatott vonal: gradiens program,
Egyéb szennyező fehérjék: HSA: humán szérum albumin, Globulinok.
NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE IONCSERÉLŐ
MonoQ – FPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
MINTAELŐKÉSZÍTÉS:
Szövetek, sejtek, biológiai
folyadékok homogenizálva 0,7M
perklórsavban, centrifugálás,
felülúszó semlegesítve KHCO3-al
FPLC oszlop:
MonoQ, v. Polyanion SI HR 5/5
Áramló fázis:
NH4-foszfát puffer, pH: 7, 0
Gradiens elúció: 0,1 – 1, 0 M
Program szerint
Áramlási seb: 0,75 mL/perc
Detektálás: 254 nm
NUKLEOZIDOK ÉS NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA
ION-PÁR HPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
(Ade, Cyt, Gua, Uri, CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP)
MINTAELŐKÉSZÍTÉS:
Szövetek, sejtek, biológiai
folyadékok homogenizálva
0,7M perklórsavban,
centrifugálás
felülúszó
semlegesítve KHCO3-al
HPLC oszlop:
Hypersil ODS
(25x0,46 cm, 5 m)
Áramló fázis:
0,025M TBAH-foszfát
pH: 6,0 és 0,08M NaCl
Lineáris gradiens elució:
MeOH 0-20% (v/v) 45perc
Áramlási seb: 0,75 mL/perc
Detektálás: 254 nm
A HPLC-ION PÁR KROMATOGRÁFIA PARAMÉTEREINEK ÖSSZEFÜGGÉSE
k’ VÁLTOZÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS MeOH ÉS NaCl TARTALMÁNAK FÜGGVÉNYÉBEN
A NUKLEOTID FOSZFÁTOK
ELVÁLASZTÁSÁNAK
OPTIMÁLÁSA
AZ
ÁRAMLÓ FÁZIS
MeOH és/vagy NaCl
KONCENTRÁCIÓJÁNAK
VÁLTOZTATÁSÁVAL
HPLC oszlop:
Hypersil ODS
(25x0,46 cm, 5 m)
Áramló fázis:
0,025M TBAH-foszfát
pH: 6,0
(Optimálisan)
0,08M NaCl
NÉHÁNY FONTOSABB ANION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA
NÉHÁNY FONTOSABB KATION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA
Köszönöm a figyelmet
HUMÁN SZÉRUM
AGP
ELVÁLASZTÁSA
ÉS MÉRÉSE
ANIONCSERÉLŐ
KROMATOGRÁFIÁVAL
KETTŐS
pH – NaCl
GRADIENSSEL
pH
7,5  9,5
NaCl 0  350 mM