Transcript METODY LIS
Současné trendy v klinické imunologii a sérologii JAN MARTINEK OSNOVA Základní principy metod v imunologii a sérologii Imunoglobuliny Problematika infekční sérologie (vybrané infekční agens) Principy metod v imunologie a sérologii - DĚLENÍ METOD Humorální Buněčné Metody nefelometrie a turbidimetrie • Stanovení: proteiny akutní fáze, složky komplementu, podtřídy IgG • Princip: měření intenzity světla • precipitace v roztoku – přímé měření množství precipitátu - zákal • kvantitativní stanovení (kalibrační křivka) Elektroforéza • Stanovení: Orientační informace o změnách v kvantitativním zastoupení jednotlivých frakcí imunoglobulínů především • Princip: Proteiny mají el. náboj podle náboje se rozdělí v elektrickém poli (albumin, , , - frakce ). • možnost denzitometrické kvantifikace ELEKTROFORÉZA I MUNOFIXACE Metody – EIA Stanovení: infekční sérologie, autoprotilátky, tumor. Markery, spec. IgE … Princip: Specifická interakce mezi antigenu a protilátky s následným stanovením Typy: ELISA, FEIA, ELISPOT, CLIA, , CLIA, ECLIA, MEIA … Metoda – ELISA Princip: komplex Ag - Ab detekován sekundární protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza) • komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab) se odstraní promytím vysoká citlivost (1ng/l) • ELISA – průkaz antigenu TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA METODA CLIA – ADVIA CENTAUR Metoda – WB, Imunodot Stanovení: Infekčních, autoimunitních, spec. IgE … WESTERN BLOT (IMUNOBLOT) Metoda – IFA Stanovení: Především autoimunitních parametrů a dále infekční agens NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE Autoprotilátky na HEp-2 buňkách : Antigeny asociované s Jaderné autoantigeny dělením buňky polynukleotidy centriola histony dělící vřeténko ribonukleoproteiny separační zóna buňky antigeny jadérek centroméra další antigeny Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy buněčné organely antigeny cytoskeletu další antigeny Komplement fixace a hemaglutinace komplement-fixační reakce je založena na vyvazování komplementu z reakčních směsí specifickými komplexy Ag s Ab – spotřeba komplementu. V druhém kroku je stanovena hemolytická aktivita komplementu (nepřítomnost protilátky se projeví lýzou). Testem jsou prokazovány směsné protilátky (nelze samostatně prokázat např. IgM). aglutinace na nosičích je precipitace převedená na aglutinaci , nejčastěji latexová aglutinace nebo pasivní hemaglutinace (HA). Všechny typy aglutinace na nosičích jsou vysoce citlivými reakcemi k důkazu protilátek. NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE Testy Buněčné imunity Funkční testy leukocytů Stanovení počtu buněk Funkční testy Fagocytosa – od metod diagnostikovaným pod mikroskopem až po aplikace na průtokovým cytometrem Fagocytosa aplikace průtoková cytometrie – využití principu, že při fagocytoze vznikají kyslíkové radikály → oxidace dihydrorodaminu na rodamin (fluorescence) Funkční testy Basotest Aktivita NK buněk Blastická transformace lymfocytů Stanovení počtu Význam: především diagnostika imunodeficitů a leukemií PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE • vrchol současných možností analýzy • buněčných suspenzí • částice jsou v laminárním proudění usměrněny do řady • cytometrie určuje: - počet - velikost (FS) -„morfologii“ buněk (SS) - přítomnost fluorescenčního signálu (FL) údaje získané pro jednotlivé buňky jsou vyhodnoceny počítačem Fluorochrom je konjugován s primární protilátkou Vyjadřování výsledků - EIA metody Index pozitivity – Cut off (referenční sérum) 0-0,9 – negativní 0,9-1,1 – hraniční >1,1 - pozitivní Kalibrační křivka – standardy Vyjadřování výsledků - IFA metody Subjektivní hodnocení, komentář Hraniční Slabě pozitivní Pozitivní Silně pozitivní Vyjadřování výsledků – metody WB, Imunodot Semikvantitativní hodnocení, komentář Subjektivní hodnocení v kombinaci se software Vyjadřování výsledků – průtoková cytometrie Procentuální vyjádření jednotlivých subpopulací s návazností na hematologické parametry (Le, Ly) U hematologických pacientů komentář MULTIPLEXY V širším slova smyslu, jakákoliv metody, kdy stanovujeme najednou (reakční prostor) více parametrů, př. „linedot“ Dnes spojeno s tzv. „microarray“ – stanovení genové exprese, proteinového profilu, ne v rutinním provozu „Kuličkové“ Multiplexy Směs „kuliček“ různé velikosti a barvy potažené antigeny Detekce jakýchkoli protilátek Není zatím v rutinní praxi IMUNOGLOBULINY A BLYMFOCYTY Hemopoéza BCR receptor, Imunoglobuliny GENETICKÁ ORGANIZACE IgH S VH DH JH S Cm S S S S S C Lokalizace genu v genomu: Těžký řetězec – 14 chromozom Lehký řetězec – λ – 2 chromozom k – 22 chromozom S S S Schéma přepis IgH genu (k,l,autoreaktivita) Diferenciace B-lymfocytů Diferenciace na antigenu nezávislá – v KD, změna membránové výbavy, přeskupení genu pro receptor Diferenciace na antigenu závislá – sekundární lymfatické orgány, somatická mutace (změny v genu BCR v přítomnosti antigenu, selekce klonu), izotypový přesmyk CHARAKTERISTIKA PROTILÁTEK DYNAMIKA PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI ONTOGENETICKÁ DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI LABORATORNÍ INFEKČNÍCH DIAGNOSTIKA NEMOCÍ: PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU kultivace mikroskopie PCR NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ) PRŮKAZ Stanovení protilátek • obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.) • retrospektivní nález (epidemiologie) Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI Množství protilátek IgG IgM IgA čas EBV Souhrn - EBV Čeleď Herpesviridae, DNA virus Kosmopolitně Rozvojové země – v dětství, západní země – až adolescence Celoživotní nosičství (latentní infekce organismu) - perzistence v organismu, brána vstupu: buňky nosohltanu, latentní infekce lymfocytů B (transformace v permanentní buněčné linie) EBV - Protilátky Neoantigeny – produkce heterofilních protilátek – Paul-Bunnell, Ericsonův test Nalezáme protilátky proti- VCA, EBNA, EA Dynamika tvorby protilátek Latentní fáze Latentní fáze – virová DNA se synchronně dělí s buněčnou DNA EBV – latentní proteiny – regulační fce, onkogenní potenciál Lytická fáze Lytická fáze – přerušení latentní fáze a produkce infekční virionů Lytická fáze – Klidové lymfocyty se mění na proliferující buňky – transformace neboli imortalizace lymfocytů Lytická fáze – selhání složek infekce – chronická EBV infekce, nádorů asoc. S EBV, imunodeficity Lytická fáze EBV infekce – analog IL10 – inhibice makrofágů a Th1 lymfo EBV - Nádory, genetika Epidemiologie a mol. Biologie – EBV se účastní řady procesů vedoucích k maligním onemocněním Gen. změny, reg. b. dělení, dif. a exp. povrch molekul, … Nazofaryngeální karcinom (jihovýchodní Asie) Burkittův lymfom Hodgkinův lymfom Dále vztav k lymfoproliferativním onemocněním spojených s vrozenou nebo získanou imunodeficiencí (Xvázaný lymfoprof. Syndrom, Wiskott-Aldrich syndrom, Ataxia teleangiectazia), (HIV) Chlamydie - Charakteristika •„atypickébakterie“bez buněčnéstěny z peptidoglykanu •intracelulárnírůst •bez vlastního energetického metabolismu •=> nelze je kultivovat na k. půdách, jen na tkáňových kulturách •=> nelze použít ATB, kterápůsobína bakteriálnístěnu (beta-laktamováATB) •růstový cyklus 48-72h =>dlouhádoba léčby 2-3 týdny Chlamydie - Druhy •Chlamydia pneumoniae –původce bronchitid, pneumonii, sinusitid. –aterosklerózy ??? •Chlamydia trachomatis •původce: zánětůurogenitálního traktu, inkluzníkonjunktivitidy(s. D-K) •lymfogranulomavenereum(sérotypyL1, L2, L2a,L3) •trachom (serotypyA, B, Ba, C) •Chlamydia psittaci –původce „papouščínemoci“ •Chlamydia pecorum Chlamydie - Diagnostika Ch. trachomatis – detekce z výtěru a moči, punktát – PCR Sérologie – ELISA + WB, Detekce LPS + MOMP Sérologie – neznalost dynamiky tvorby protilátek, promořenost populace, problém odlišení chronické infekce Hodnocení protilátek u Chlamydií IgM - IgA - IgG Hodnocení Negativní nález (falešně neg. v příliš časné fázi infekce) + - - Možná počínající infekce. Vhodné opakovat vyšetření za 14 dní + +- +- Akutní infekce na počátku + + + Probíhající infekce - + + +- Perzist.IgG po proběhlé infekci Chronická či proběhlá infekce, posuzovat dle kliniky Borrelie Diagnostika především nepřímá – ELISA následná konfirmace WB Nesrovnalosti mezi výrobci Děkuji za pozornost