Transcript Bazofilný degranulačný test

Bazofilný degranulačný test na prietokovom cytometri
metodické aspekty
Bobovčák M., Klinické laboratórium VVÚCHP, Nová Polianka,
Vysoké Tatry , Slovensko
BDT / BAT – funkčný test - FC – (Saint-Laudy 1994)
- Alergie - Typ I hypersenzitivita (IgE)
- Pseudoalergie - nonIgE, komplement, IgG, TypII,III , auto anti- IgE
- Nezachytáva Typ IV – bunkami sprostredkovaná hypersenzitivita
Princíp
Periférne Leu (WB) + stimulans v aktivačnom pufri + Inkubácia
detekcia expresie CD63(gp53) na FC identifikovaných bazofiloch
Vzorka
BSB/Stimul
FlowCast
Bühlmann
Basotest
Orpegen
Izolované Leu 50 ul
ACD, EDTA
100 ul WB
heparín
20/100 ul
0/50 ul
BD FastImmune
BD
100 ul WB
heparín
0/20ul
Inkubácia
40 min
10 pred/20 min
10 –15 min
Pozitívna K
FcεRI
N-FMLP
N-FMLP
Stop/Lýza EDTA?+Chlad/ Lýza
Farbenie
IgE-Fitc/CD63-PE
Ľad / Lýza
CD63-FITC/ IgE-PE
Ľad or EDTA/ Lýza
CD63/ CD123/DR
Cieľ: metodický postup pre optimálny BDT
pre vyšetrenie alergie a pseudoalergií (liečivá)
BDT – predanalytická fáza
Pacient:
vysadenie liekov – 14 dní steroidy, 48 hod. anti-histaminika/leukotriény
Odber:
heparín, štandardizovaný (5-7ml vacutainer a pod.) do 4 (24?) hod.
(sklo, plast, laminárny box, sedimentácia plnej krvi na gradiente 1077
3ml/3ml 40-50 min, odpipetované: 800 ul plazmy)
Plná krv
Izolované Leu
centrifugačne
Jednoduchosť
++++
+++
+
++++
Nešpecifická
Stimulácia+TR
+
++
++++
+
Mononukleáry Plazma
gradient
heparín
Interakcie
(Liečivá)
Ery,Tr
proteíny
Ery,Tr
Tr
Tr
proteíny
Farbenie + FC
++
+++
++++
++++
BDT – reakčné pomery - postup
Apyrogénne, sterilné, 2 ml skúmavky EPP /otestovať/ , laminárny box
50 ul - Stimulačný pufer BSB
(NC),
- 1ug/ml a-IgE(De2), 2uM N- FMLP
(PC),
- stimulans / alergén v BSB
BSB = 20mM HEPES, 5 KCL,133 NaCL, 7 CaCl2, 3.5 MgCl2, 1 mg/ml HSA pH 7,4 (proTK )
10 ul
50 ul
r IL3 v BSB 10ng/ml zvyšuje senzitivitu (literatúra)
heparínovej plazmy / KO – analyzátor /
INKUBÁCIA 37oC, vodný kúpeľ
20 min silné alergény (inhalačné, potraviny... )
40 min slabé alergény (liečivá... ) (kontrolný pacient)
STOP: ľadový kúpeľ 5 min.
FARBENIE protilátkami: 25-30 min. na ľade
PREMYTIE pufrom WB = 0,1 % BSA v PBS 1,5 ml
RESUSPENDOVANIE 600ul WB –
AKVIZÍCIA - FC (300 – 500 - 1000 bazofilov)
Negatívna kontrola BSB – do 10% CD63+Bazo n=30
spontánna stimulácia / vylúčenie nešpecifickej stimulácie /
12
n=15
10
8
6
4
2
0
Neink.
Ľad
EDTA
Pozitívna kontrola
1. Anti IgE(De2) 70%-90% CD63+Bazo ( 25% nonresponder)
2. N – FMLP peptid 30%-60% CD63+Bazo
3. Anti IgEeRI ? - výhodnejšie ako anti IgE (5% nonresp. Lit.)
PC – a-IgE
NC - pufer
CD63 Fitc
CD63 Fitc
SS
SS
Stimulans / Alergény
Silné alergény : inhalačné, potraviny, latex, jedy /insekty/
-veľmi dobrá korelácia s inými testami aj s BDT z plnej krvi u latexu vynikajúca.
Komerčne dostupné pre BDT :napr. Bühlmann Použiteľné Stallergen, Sevapharma ! PNU jednotky
Kritická : 1.čistota /!!!! aditíva ako azid, mertiolát, fenoly interakcia s bielkovinami, trombo, ery...
2.koncentrácia v teste musí byť predtestovaná !!! S ohľadom:
- na senzitivitu – čo najvyššie percento CD63+bazofilov
- na špecifitu – pacient reaguje v závislosti od dávky,
nealergický pacient nereaguje pri danej konc. alergénu
Slabé alergény : liečivá a pod.= nízka odpoveď CD63+Bazo
Senzitivita lepšia pri použití izolovaných Leukocytov
komerčne dostupné pre BDT :napr. Bühlmann – literatúra ,
Kritické!!! : Čistota, Koncentrácia - v teste využiľ kontrolu na negatívneho pacienta, pracovať vždy
dávkovo /najmenej 2 koncentrácie/ a NC v duplikáte.
Interakcie – inhibícia BDT, s bunkami a bielkovinami
Použitie originálnych farmák. Vodítko www. Bühlmann.com
Testované u nás:
ACP, Ibuprofen, Penicilín G, V,Amoxicillin ,Ciprofloxacin Arduan, Norcuron
BDT – identifikácia bazofilov
1.IgE+ bunky, intenzita farbenia klesá po aktivácii
2.CD203c + bunky, intenzita farbenia stúpa po aktivácii
3.CD123+ bunky
Aktivácia
1.CD203c+ bazofily, mechanizmus upregulácie nejasný
2. CD63+ bazofily, enzymatická kaskáda pri aktivácii a degranulácii
vedie k externalizácii intracelulárnych komplexov s transmembr. CD63
Protilátky
aCD203c-PE ( 97A6) bazofily,mastocyty, megakaryoc. CD34+bb. - Immunotech
aCD123 - PE (IL3Rα, 9F5) bazo, mono, Eo, dendritické bb. - BD
aHLA DR- PCP (1.243, Bazo- Low SS, Eo- High SS), (B, Mono, dendrit.bb.+) - BD
aCD63 – FITC (gp53, H5C6) akt. bazo, akt. Trombo, Monocyty,MF -PharMingen
aCD45 – PC7 Pan Leu Trombo- , Ery - -Immunotech
63 / 203c / 45 versus 63 / 123 / DR / 45
CD203c PE
WB
CD203c PE
45+
CD203c PE
WB
Plazma
SS
SS
CD203c PE
45+
Plazma
SS
CD123 PE
45+
Plazma
SS
SS
CD123 PE
45+ DRPlazma
SS
Stratégia gatingu 63-FITC/123-PE/HLADR-PCP/45-PC7
CD45 PC7
CD123 PE
DR-PCP
1
2
Bazo
Leu – Live Gate
SS
FW
DR-PCP
SS
3
CD63 Fitc
CD123 PE
Bazo
Aktivované
Bazo
SS
SS
Live Gating CD45, Low SS, kompenzácia !!!
SS
Pozitivita vs Negativita
CD63 Fitc
CD63 Fitc
PC – a-IgE
559 bazo
94,6%
SS
1
TopCast
666 bazo
91,0%
NC
514 bazo
2,0%
SS
SS
1
1
CD63 Fitc
CD63 Fitc PC – FMLP
497 bazo
35 %
CD63 Fitc
PC – FMLP
754 bazo
7%
SS
SS
2
CD63 Fitc
3
3
Zodac, Flixonase, Seretide
PC – IgE
700 bazo
8%
SS
Liečivá , Interakcia trombocytov
CD63 Fitc
CD63 Fitc
NC
609 bazo
15%
SS
1
SS
1
CD63 Fitc
Ibuprofen
345 bazo
14%
CD63 Fitc
ACP
973 bazo
18%
Ibuprofen
742 bazo
7%
SS
1
CD45 PC7
CD62P Fitc
45+
1%
0,4 %
5%
2
SS
SS
Trombocyty, interakcia s liekmi, koagregáty s Leu, aktivácia
Reprodukovatelnosť IntraAssay CV
25
20
15
10
5
0
1
2
3
Negatívne kontroly, triplikáty, n=10 - CV 15,9 %
Pozitívne kontroly n=5, duplikáty – CV 4,3 %
Hodnotenie – silné alergény % CD63+ Bazofilov
NC<10%, PC(IgE) 70-90%, PC(FMLP) 30-70%, Stimul > 20%
Hodnotenie – slabé alergény (liečivá)
Stimulačný index SI=%akt.Bazo Test / %akt.Bazo NC
Negatívne SI<1,3 Dubiózne SI= 1.3-2,0 Pozitívne SI>2,0
Negativita neznamená , že pacient nezareaguje klinicky !
!dávkový režim, duplikáty, optimalizovaná cc!
Záver
Prezentovaný Bazofilný degranulačný / aktivačný test
vo vlastnej optimalizovanej modifikácii, v ktorom sme
skombinovali aj niektoré výhody komerčne dostupných
testov, je použiteľný pre testovanie hypersenzivity
na silnejšie alergény , slabšie alergény i liečivá,
za dodržania vyššie spomínaných odporúčaní.
Je pracovne nenáročný a lacnejší ako komerčné sety.