Transcript Imunológia –praktické cvičenie č. 1.

Imunológia –praktické cvičenie č. 1.
bunky imunitného systému
Použité zdroje
 Buc,M. a kol.,: Praktické cvičenia z imunológie,
vysokoškolské skriptá, PALAESTRA, Bratislava 1993,
ISBN 80-88718-01-5
 http://www.vpl.sk/zc/img/3_Kossarova_Imunodeficie
ntne_stavy.pdf
 Bunky imunitného systému dostupné na
https.ics.upjs.sk~paulikovaimufilestahajimu2.pdf
hematopoéza
•
Bunky imunitného systému
•
-rôzne dlhý čas života
•
- úbytok je dopĺňaný hematopoézou
•
Hematopoéza
•
- formovanie a vývoj červených a bielych krviniek z kmeňovej pluripotentnej bunky
•
-u dospelého jedinca prebieha najmä v kostnej dreni (medulárne)
•
-základom hematopoézy je
• pluripotentná kmeňová bunka, ktorá sa diferencuje na
lymfoidné a myeloidné kmeňové bunky
Hematopoéza
 -z kmeňových buniek vznikajú
progenitorové bunky, ktoré sú nasmerované k
diferenciácii na základné typy krvných buniek:
 Erytrocyty
 lymfocyty
 trombocyty
 monocyty
 Granulocyty
 -Hematopoéza je regulovaná najmä cytokínmi:
 IL-3 (multilineage-CSF)
 GM-CSF
 M-CSF
 G-CSF
 erytropoetín
 IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8,IL-9
klasifikácia
• prítomnosť membránových
znakov(rozpoznávacie glykoproteíny) na
povrchu bunky
• CD (na všetkých leukocytoch)
• expresia receptorov na rozpoznávanie antigénov
(len na T a B –Ly)
• MHC antigény
 Systém bunkových znakov CD –
znak (marker)
 CD = cluster of differentiation
 CD znak – jedinečná molekula
alebo komplex molekúl,ktoré
bunka exprimuje
 Tieto molekuly pomáhajú
diferencovať typ (subtyp) bunky, jej
maturačné štádium, stupeň
aktivácie...
 Názov pozostáva z písmen CD a
číslic (napr.:CD3,CD8,...)
CD znaky
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
CD3 –len naT –Ly (na všetkých subtypoch)
CD4 –TH
CD8 –TC
CD19 –len naB –Ly
CD64 –monocyty
CD66 –PMNLs
CD68 –makrofágy
CD16 –NK bunky
CD40 –dendritické bunky
CD33 –všetkymyeloidné bb.
Polymorfonukleárne lekocytyPMNL
 Viaclaločnaté jadro a granuly v cytoplazme
 Na základe rozdielneho farbenia granúl rozlišujeme 3
typy granulocytov:
 Neutrofily–nefarbia sa ani bázickymi ani kyslými
farbivami
 Eozinofily–farbia sa kyslými farbivami na červeno
 Bazofily–farbia sa bázickými farbivami na
tmavomodro
neutrofily
•
•
60% z leukocytov (4,3–11x109/1lkrvi)
Veľkosť: 15μm
– Nezrelé –tyčka (tvar jadra)
– Zrelé – segmentované jadro
Vcytoplazme:
•
-granuly s baktericídnymi látkami –primárne (azúrofilné) obsahujú
hydrolázy, myeloperoxidázu
•
Sekundárne – obsahujú laktoferín, lyzozým, alkalickú fosfatázu,
kolagenázu...
•
Glykogén –zdroj glukózy pri anaeróbnej glykolýze → PMNL môžu
zostať v poškodenom tkanive s nízkym obsahom O2, napr.
vmiestebakteriálnejinfekcie
Bunková membrána:
•
Receptory (Fc R pre IgG, CR), adhezívne molekuly (integríny, selektíny
neutrofily
FUNKCIA:
• Základné bunky 1. obrannej línie proti patogénom,
cudzorodým bb.
• Profesionálne fagocyty
• enzýmy sekundárnych granúl rozkladajú antigén
(Ag)
• Dôležitá úloha v zápalovom procese
(rýchla mobilizácia, uvoľnenie mediátorov
zápalu)
eozinofily
•
•
4% zo všetkých PMNL
18 μm
V cytoplazme:
•
•
okolo 200 granúl – hlavný bázický proteín (MBP), kyslá fosfatáza,
arylsulfatáza, eozinofilná peroxidáza, kationický proteín eozinofilu
-MBP pôsobí toxicky na parazity a nádorové bb., väzbou na bazofilné
bb. z nich uvoľňuje histamín
Na membráne:
- receptory pre IgE a zložky komplementu - dôležitá úloha pri alergických
reakciách
FUNKCIA:
•
proti parazitárnym infekciám (hlavne proti helmintom v črevnom trakte)
•
proti nádorovým bunkám
•
Účasť pri zápalových reakciách ( sú aktivované lymfocytmi)
•
alergické reakcie
•
schopnosť fagocytózy
bazofily
•
<0.2% z Leu
•
•
Morfologicky sa podobajú tkanivovým mastocytom,
ochrana mukóznych povrchov tela
Cytoplazma:
•
Granuly – veľké množstvo zápalových mediátorov
(heparín,histamín...);
•
Neobsahujú peroxidázu
Membrána:
– Receptory FcRε (pre IgE)
FUNKCIA:
•
-alergické reakcie
•
-nefagocytujú
mastocyty
•
•
•
•
Tkanivové bunky
30μm
Mononukleárne bunky s metachromaticky zafarbenýmig ranulami
Relatívne maléj adro
- v spojivovom tkanive, hlavne pri krvných, lymfatických
cievach a pri periférnych nervoch
- blízko epitelových povrchov(dýchací, tráviaci systém a koža)
Cytoplazma:
•
granuly : zápalové mediátory (heparín,histamín...),
neobsahujú peroxidázu
Membrána:
•
-receptory FcRε (preIgE)
Funkcia : hlavné bunky pri alergických reakciách
Mastocyty
monocyty
•
•
6-8% – mononukleárne bb.
Okrúhly tvar, veľa cytoplazmy, veľké, excentricky uložené jadro
Cytoplazma : vakuolizovaná, farbí sa slabo bazofilne (sivo-fialovo) .
• (Monocytóza so zvýšením množstva leukocytov je aj priaznivým
symptómom pri septických procesoch a infekčných ochoreniach)
FUNKCIA:
• Profesionálne fagocyty
• APC
•
*Zrelé monocyty putujú z kostnej drene do krvi, kde zostávajú cca1530 hodín Potom adherujú na cievny endotel a opúšťajú krvné riečište
diapedézou, premiestňujú sa do tkanív, kde sa premieňajú na
makrofágy.
Monocyty
Antigén prezentujúce bunky =
APC(Antigen Presenting Cells)
• DENDRITICKÉ BUNKY (DC)
• MAKROFÁGY
• B -LYMFOCYTY
• FUNKCIA:
• vychytanie Ag
• spracovanie Ag
• prezentácia Ag peptidov špecifickým T -Ly
makrofágy
•
Determinačné povrchové znaky:
CD54, CD68, MHC, Fc receptory, C receptory
Monocyt z krvi →prechod do tkaniva →premena na makrofág
–
–
–
–
mononukleárne fagocyty
dĺžka života 75 dní
antigén prezentujúce bb. = APC
Tkanivové makrofágy –1. obranná línia hostiteľa
•
VÝSKYT:-
•
Alveolárne v pľúcach
•
•
•
•
•
•
Kupfferove bb. v pečeni
histiocyty v spojivovom tkanive
mikroglia v CNS
osteoklasty v kostiach
peritoneálne a pleurálne v seróznych dutinách
Intravaskulárne v endoteli kapilár
makrofágy
• FUNKCIE:
– Schopnosť rozpoznať, vychytať, spracovať a
prezentovať antigén
– fagocytóza
– Expresia MHC molekúl II. triedy
– Produkcia imunoregulačných látok
– Schopnosť odovzdávať nešpecifické stimulačné signály
– Produkcia reaktívnych molekúl
Dendritické bunky DC
 v nelymfatických periférnych tkanivách
 Langerhansove bb.(koža, dlaždicový epitel ústnej





dutiny, pažeráku a pošvy)
intersticiálne DC (srdce, obličky)
v cirkulácii : DC v periférnej krvi (0,4 %)
závojnaté bb.(aferentné lymfatické cievy)
v sekundárnych lymfatických tkanivách : vmedzerené
DC
v medule týmusu týmusové DC
• Dendritické bunky (DC)
• FUNKCIA:
• najvýkonnejšie APC
• schopnosť aktivovať naivné T –
Ly
• fagocytóza (častice a mikróby)
• makropinocytóza (solubilné Ag)
• Závojnatá DC + Ly
lymfocyty
• Ly : malý, stredný, veľký
• Malý 8-12μm.
Jadro:
- okrúhle alebo oválne tvorené masami chromatínu
Cytoplazma:
- úzky lem, svetlomodrá
• T–lymfocyty (65–75%)
• B–lymfocyty(20–30%)
lymfocyty
lymfocyty
 Lymfocyty - vyvíjajú sa z hematopoetickej kmeňovej
bunky v kostnej dreni
 T lymfocyty migrujú do thymusu,
 B lymfocyty zostávajú v kostnej dreni
 B lymfocyty - zodpovedné za humorálnu časť (Ab)
 T lymfocyty - celulárna časť imunitnej reakcie
• B-lymfocyty: produkujú a secernujú Ab do telesných
tekutín, zastupujú preto humorálnu imunitu
• T-lymfocyty: reagujú priamo s cieľovými bunkami
(napr. ktoré boli napadnuté vírusmi alebo tumorózne
zvrhnuté), preto reprezentujú bunkovú imunitu
• Obidve populácie majú na svojom povrchu odlišné
glykoproteíny, ktoré môžu byť dokázané pomocou
monoklonálnych protilátok
T lymfocyty
TH(helpery) CD4:
- Regulujú humorálne aj bunkami sprostredkované imunitné odpovede
– pomáhajú
TS(supresory) CD8 :
-
Môžu potláčať imunitnú odpoveď
TC(cytotoxické) CD8:
Efektorové bb. S cytolytickým účinkom
TDH(delayed-type hypersensitivity reaction)sprostredkujúoneskorenýtyphypersenzitivity
•
TH a TS majú odlišné vlastnéa ntigény, podľa ktorých sa identifikujú
T lymfocyty
• Dozrievanie v týmuse je sprevádzané identifikáciou
•
•
•
•
provrchových označení CD (cluster of differentiation –
diferenciačných antigénov)
CD3- prenášač signálu z antigénneho receptoru do vnútra
bb, vedie k aktivácii b
CD4, CD8 prítomné pôvodne u spolu všetkých ly,
umožňujú rozdeliť T-lymf.
CD4 - prítomný u T helper bb, komunikuje s molekulami
HLA II
CD8 - prítomný u cytotoxických buniek, komunikuje s
molekulami HLA I
Špecifická imunita sprostredkovaná
bunkami
• T bunky
- po stimulácii sa stávajú efektorovými bunkami
(priamo napádajú a eliminujú bb napadnuté vírusmi
alebo tumorózne zmenené)
- riadia spoluprácu rôznych imunitných bb
(syntetizujú molekuly, ktoré pomáhajú iným bunkám
zničiť patogéna)
B lymfocyty
• B-bb dozrievajú v prostredí kostnej drene
• Zrelé B-lymf nesú na svojom povrchu molekuly
imunoglobulínov, ktoré slúžia ako špecifický receptor
pre antigén.
• V prítomnosti Ag (týmusindependentné Ag) alebo aj v
spolupráci s T-lymf (týmusdependentné Ag) sa menia
B-lymf na plazmatické bunky, ktoré produkujú veľké
množstvo špecifických Ab
Plazmatické bunky
NK bunky
•
•
•
•
CD16, CD56,CD57
5–15% , slezina
Nulové bb.=non–B,non–T
Majú Fc receptory
Bunková zložka vrodenej imunity
Funkcie:
-lýza nádorových a vírusom infikovaných bb.
(nešpecifická cytotoxicita bez predchádzajúcej senzibilizácie)
- produkcia cytokínov zapájajúcich sa do regulácie iných
procesov
- rozpoznávajú cieľové bb. bez MHC restrikcie
- IL-2; IFN zvyšujú proliferáciu a cytotoxickú aktivitu NK
cytopl. Granuly obsahujú perforín, serínovú esterázu
Izolácia mononukleových bb
• Z periférnej krvi
• Za fyziol podm. : z 1 ml krvi....1-2x 106 mononukl.
bb.(lymfocyty a monocyty v pomere 80% : 10%)
CIEĽ : oddelenie ery a granulocytov
METÓDA: diskontinuálna gradientová centrifugácia
POSTUP: krv +heparín (konc. 10j./1 ml krvi)
-premiešať + fyziol.roztok (1:1)
- do skúmavky s 5 ml zriedenej krvi navrstviť
2,5 ml separačného roztoku (verografín)
- 20 min. centrifugácia
Izolácia mononukleových bb
 VÝSLEDOK :
 po centrifugácii sa nad separačným roztokom utvorí
belavý prstenec mononukleových bb., ktoré odsajeme
pipetou
 Získané bb. centrifugujeme
 Sediment 2x premyjeme vo fyziolog. roztoku
 bb. spočítame v Bürkerovej komôrke (1x106 )
Separácia T aB lymf. Na základe
tvorby roziet
 T a B lymf. : rôzne membránové receptory pre väzbu s
ery iných živočíšnych druhov
 T lymf. : receptor pre baranie ery – tvorba E-roziet
 B lymf. : receptor pre myšie ery – tvorba M-roziet
 Ery sa opracúvajú chemicky (neuraminidázou) –
pevnejšia väzba s lymf.
Separácia T aB lymf. Na základe
tvorby roziet
• POSTUP:
• Suspenzia mononukleových bb. + premyté a
•
•
•
•
•
•
resuspendované baranie ery (1:1), centrifugácia
Inkubácia 30 min. pri 4̊ C, navrstvenie separačného
roztoku (verografín), centrifugácia
CIEĽ :
nad separač. roztokom ostanú nerozetujúce bb.(odsatie)
Rozetujúce bb. Sedimentujú na dno skúmavky
VÝSLEDOK:
Získanie suspenzie lymfocytov (T lymf.- E-rozety) (95%
čistota)
Rozetové testy
 Aktívne rozety – vyššia avidita receptorov pre baranie
ery (aj pri ich malom počte)
 Celkové rozety – po 18 – 24 hod inkubácii pri nadbytku
ery.
 Aktívne rozety lepšie odrážajú imunitný stav pacienta
Rozetové testy
• POSTUP :
- 5ml krvi do heparínu
izolácia lymfocytov
- Pridať suspenziu ovčích ery ( pre aktívne rozety v c 0,2%,
pre celkové rozety 0,1%)
- Pri stanovení celkových roziet – na 24 hod do ľadu
CIEĽ :
- počítanie lymfocytov a roziet v Bürkerovej komôrke
VÝSLEDOK :
- Rozeta : lymf. + najmenej 3 ery
- Aktívne r. : 25 +/- 10%
- Celkové r. : 65 +/- 10%
Pod mikroskopom počítame počiet roziet a čistých lymfocytov do
100, počet roziet udáva % počet B alebo T lymfocytov
Lymfocyt
rozety
Morč.ery