Transcript IDB HC 9 en 10 Detectie en isolatie van nucleïnezuren

H05IDB
Marcel Lombaerts
G3.052
IDB HC 9-12: Detectie en isolatie
van nucleïne zuren
• Principles and Techniques of......(Wilson and
Walker) 7th edition
– H5.1, 5.2, 5.6 t/m 5.7.2, 5.8 en 5.10 t/m 5.10.4
– H10.2.1, 10.4.1 en 10.4.4
• Biology (Campbell), 9th edition
– H16.1 en H20.1 en 20.2
• Biochemistry (Campbell and Farrel), 7th edition
– H13.1, 13.2, 13.6 en 13.7
IDB HC 9-10:
basis (+) nucleïnezuren
I.
II.
III.
IV.
V.
Structuur van DNA and RNA
DNA sequenties bij NCBI
Zuiveren van DNA, RNA and mRNA
Restrictie enzymen
Gel electrophoresis
I. Structuur van nucleotiden
DNA en RNA zijn polymeren.
Bouwstenen zijn nucleotiden.
Suikers
5
4
1
3
2
5
5
1
4
3
2
1
4
3
2
Stikstofbasen
U
U
5
5
1
4
3
2
1
4
3
2
5’ en 3’
5
3
H2 O
5
3
RNA!
Ketens
U
U
5
5
1
4
3
2
1
4
3
2
Baseparing
G
C
A
T
G
C
T
A
C
G
T
A
Baseparing
G
C
A
T
Opdracht
RNA is een polymeer van
rNTPs
RNA is instabieler dan DNA
• RNA heeft OH groepen aan de C2 (2’),
deze maken het molecuul gevoeliger
voor hydrolyse
• DNA heeft geen 2'-OH is is daardoor
stabieler
• Dat is logisch...
Verschillende typen RNA
moleculen
• Messenger RNA (mRNA)
– mRNA bevat de code van de te maken eiwitten
– Complementair aan de coderende DNA sequentie
• Ribosomal RNA (rRNA)
– Vormen de ribosomen (samen met enkele eiwitten)
• 3 typen in prokaryoten (5S, 16S, 23S)
• 4 typen in eukaryoten (5S, 5.8S, 18S, 25-28S)
• Transfer RNA (tRNA)
– Transporteerd aminozuren naar de plek van
eiwitsynthese
(small RNA: snRNA, snoRNA, miRNA, siRNA,
piRNA)
RNA
Er zijn verschillende RNA’s
• mRNA: worden vertaald
naar eiwitten
• rRNA: vormen de
ribosomen die nodig zijn
voor translatie
• tRNA: nodig voor het
maken van eiwitten
(gekoppeld aan
aminozuren)
• Voorbeeld tRNA
• RNA’s kunnen een
intramoleculaire
baseparing hebben
(voornamelijk tRNA en
rRNA)
 Voorbeeld 16S rRNA
Lokatie in de cel
• DNA:
constante factor
(“genetic makeup”)
• RNA:
verschillen per
celtype, fase,
omgeving enz.
(“information flow”)
Verschillen tussen
RNA en DNA
RNA:
• 2’ OH group (ribose)
• Uracil binds Adenine
(A,U,C,G)
• Multiple types and roles
• Often permanently
modified via splicing
• Usually single-stranded
• Intramolecular binding
DNA:
• 2’ H (deoxyribose)
• Thymine binds Adenine
(A,T,C,G)
• One biological form
• Permanently modifications
are rare (mutation)
• Double stranded
• Double helix structure
II. DNA sequenties: NCBI
site
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
NCBI site
III. Isolatie en zuivering van
nucleïnezuren
• Welk nucleïnezuur heb je nodig? (ssDNA,
dsDNA, RNA, mRNA)
• Welk organisme? (menselijke cellen, lagere
eukaryoten, planten, prokaryoten, virussen, enz.)
• Uitgangs materiaal? (heel orgaan, cel culture,
bloed enz.)
• Wat ga je ermee doen? (PCR, cloneren,
labellen, RT-PCR, cDNA synthesis, enz.)
Methode (algemeen)
isolatie nucleïnezuren
• Cellen openbreken
• Nucleïnezuren scheiden van de rest
(eiwitten en membranen)
• Nucleïnezuren isoleren
DNA isolatie fenol
chloroform (1)
• Homogeniseren weefsel, lysis, proteinase K
• Eerst fenol en daarna fenol : chloroform : isoamylalcohol
(25:24:1)
• Centrifugatie
DNA isolatie fenol
chloroform (2)
Precipitatie (neerslaan)
- isopropanol, (soms KAc en)
ethanol (eindconcentratie 70%)
of ammoniumacetaat
- incuberen: -20 °C tot 4 oC
Afdraaien
Wassen met ethanol 70-75% bij
KT/ 4 oC
DNA isolatie fenol
chloroform (3)
Drogen
- “aan de lucht”
- bij 37, 50, 60 oC
- “speedvac”
DNA oplossen in
10 mM Tris 1mM EDTA (T10E1)
pH 7,4 - 7,6
Oplossen RNA in RNase vrij H2O
(soms TE)
Waarom?
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Cellen wassen?
Wat zit er in lysisbuffer?
ProtK stap?
Fenol?
Wassen met 70% EtOH?
Waarom drogen?
TRIS in de buffer?
EDTA in DNA buffers?
Vaak geen EDTA in RNA oplosbuffers?
Andere methoden…
• fenol/chloroform extractie en ethanol
precipitatie
• silica membraan kolommen
• anion exchange resins (ionenwisselaars)
• magnetische beads
DNA isolatie: silica
membraan
- Homogeniseren
(lyseren, met zout)
- Centrifugeren
-Elueren (laagzout)
Roche,
Fermentas
Opdracht
Een analist gebruikt de silica membraan methode voor het
isoleren van DNA uit cellen. Na het lyseren en het
verwijderen van het celdebris brengt hij het sample met
veel opgelost zout op de silica kolom. Vervolgens draait hij
af en verwijdert de flow-thru. Hierna wast hij de kolom met
water (flow-thru wordt weer verwijderd) waarna het DNA
geëlueerd wordt met een laag zout buffer. Na meting op de
NanoDrop blijkt dat er geen DNA aanwezig is in het sample.
Leg uit wat de oorzaak hiervan is.
Anion-exchange resin
• Homogeniseren
– lyseren, zonder zout
• Centrifugeren
• Elueren (pH en zout concentratie)
Qiagen kits
Elutie anionen wisselaar
kolom
Opdracht
Magnetic particles/beads
- Homogeniseren met balletjes (silica coated)
- Magnetiseren
- Wassen
- Elueren (losmaken van de balletjes)
EZ1 Biorobot, Qiagen
Magnapure, Roche
Kingfisher
Cobas Ampliprep
Overzicht
http://learn.genetics.utah.edu
RNA isolatie
• Erg vergelijkbaar met DNA isolatie (phenol
chloroform procedure)
• In de cel zit veel meer RNA dan DNA
• RNA isolatie: meestal totaal RNA (rRNA, mRNA,
en in mindere mate tRNA)
• mRNA (poly A+ RNA) ≈ 1-5% van het totale RNA
mRNA isolatie
• 1-5% van het totaal RNA in eukaryoten is mRNA
• het merendeel is rRNA
TTTTTTT
Oligo (dT)25 bead
Poly (dT) bead
• genexpressie onderzoek
Werken met RNA
RNase!!!!
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
Bewaar RNA bij (-20°C of) -80°C, werk op ijs
Draag handschoenen
Gebruik DEPC-treated water om oplossingen te maken
Voeg eventueel RNase inhibitors toe
Gebruik RNase vrije epjes en puntjes
Andere materialen: hitte (180 ºC gedurende enkele uren),
wassen met DEPC water, NaOH of H2O2
Maak een aparte RNA ruimte? RNA lab
DNA / RNA
DNA / RNA hoeveelheid & kwaliteit
DNA / RNA concentratie
bepalen
[DNA] of [RNA]: absorptie of emissie (fluorescentie)
Licht (x nm
golflengte)
Absorptie x nm
Licht (x nm
golflengte)
Emissie  fluorescentie y nm
excitatie
DNA / RNA concentratie
bepalen (absorptie)
I. Concentratie DNA & RNA met UV-VIS spectrofotometer (absorptie)
Licht (x nm
golflengte)
Absorptie x nm
DNA / RNA concentratie
bepalen (absorptie)
I. Concentratie DNA & RNA met UV-VIS spectrofotometer (absorptie)
1) Meet de A260 nm (OD260)
A260=1 dan 50 g/ml DNA of 40 g/ml RNA
concentratie DNA in g / ml = 50 * absorptie DNA bij 260 nm
concentratie RNA in g / ml = 40 * absorptie RNA bij 260 nm
2) Meet bij 280 nm = eiwitten
Bepaal de 260 / 280 ratio:
DNA: A260/280=1,8
RNA: A260/280=2,0 (pH7,5)
In de praktijk: tussen 1.6 en 2.0 liggen – (redelijk) eiwitvrij DNA / RNA
Opdracht
• 5 l van een DNA oplossing wordt
doorgemeten in een eindvolume van 1 ml,
de OD260 = 0,213. Cuvetlengte is 1 cm
• Wat is de concentratie van deze DNA
oplossing?
DNA / RNA concentratie
Nanodrop UV-VIS
spectrofotometer
Rekent zelf de
concentratie en A260/280
verhouding uit
DNA / RNA concentratie
bepalen (fluorescentie)
II. Concentratie DNA & RNA d.m.v. fluorescentie
Licht (x nm
golflengte)
Emissie  fluorescentie y nm
excitatie
DNA / RNA concentratie
Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen
Picogreen toevoegen
aan dsDNA 
fluorescentie
DNA / RNA concentratie
Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen
1 Maak een ijklijn
2 Sample waarvan
je de concentratie
wilt weten
375 ng / ml
DNA / RNA concentratie
Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen
DNA / RNA concentratie
Fluorescentie (Picogreen) vs UV-VIS
Picogreen
UV-VIS
meet dsDNA
geen contaminanten
sensitief
meet dsDNA, nucleotiden, RNA
interferentie door contaminanten
minder sensitief
(A260 van 0.1 = 5 ug/ ml DNA)
DNA / RNA kwaliteit
Agilent Bioanalyzer
Gel electroforese
www.mblab.gla.ac.uk
biotrek.rdrake.org/img/gallery/
33electrophore
www.ucd.ie
DNA / RNA kwaliteit
DNA kwaliteit
RNA kwaliteit
1: 2
2:1
RIN waarde
(RNA Interety Number)
DNA / RNA kwaliteit
IV. Restrictie enzymen
(H5.6 Wilson & Walker 7th)
• Enzymen die DNA aan specifieke
sequenties (meestal palindromen) kunnen
binden en de suiker-fosfaatketen kunnen
verbreken (endo-nuclease)
• Betrokken bij afbraak “vreemd DNA”
• Vele geïdentificeerd (500+)
• Best bekend: type II restrictie enzymen
• Vele zijn commercieel verkrijgbaar
Restrictie enzymen
(H5.6 Wilson & Walker 7th)
Voorbeeld: EcoRI: herkent een 6 base-pair
palindromische sequentie
5’---GAATTC---3’
3’---CTTAAG---5’
5’---G
AATTC---3’
3’---CTTAA
G---5’
---GAATTC---
Restrictie enzymen
(H5.6 Wilson & Walker 7th)
Restrictie enzymen
Blunt
Sticky
(H5.6 Wilson & Walker 7th)
Roche: SuRE/Cut buffers
V. Agarose gel electroforese
• Agarose gel scheid DNA
fragments o.b.v. grootte
• Kleine fragmenten gaan
sneller door de gel
• Buffer: bv TBE of TAE
Gel running
DNA gel electrophorese
• Moleculair weight markers =
DNA fragmenten met bekende
grootte
• Loading buffer
• EtBr/Sybr Safe
• 0.4-2% agarose gel
• Gel buffer/running buffer
Agarose gel electrophorese
DNA “kleuren”:
• EtBr
• Let op: is
carcinogeen!
• SyBr Safe
DNA Gel Electrophoresis
Zijn de volgende opmerkingen juist
of onjuist?
• Een hoog percentage agarose gel (2%) is
geschikt om twee PCR fragmenten van 7000 bp
en 7500 bp van elkaar te scheiden
• De pH van de buffer heeft invloed op de migratie
van DNA door de gel
• Je zou i.p.v. TBE buffer ook 0,9% NaCl kunnen
gebruiken voor de electroforese
• DNA migreert in een agarose-gel van de
kathode (-) naar de anode (+)
http://learn.genetics.utah.edu/