Transcript RNA synthesis & processing

ร ัชนีกร ก ัลล์ประวิทธ์
2557
Gene : ส่ วนของ DNA ที่ transcribe ไปเป็ น RNA หรื อ protein
Central Dogma
DNA
RNA
protein
RNA synthesis (transcription) เป็ นขั้นตอนแรกในการแสดงออกของยีน
โดยการแปลรหัสจากเบสบนสาย DNA มาเป็ นลาดับเบสของ RNA
2
Transcription : ถูกควบคุมในทุกเซลล์
ใน prokaryotes  3% ของยีนจะมี
transcription ในขณะทีย
่ น
ี ของ differentiated
eukaryotic cells 0.01% เท่านัน
้
ทีจ
่ ะถูก transcribed ณ เวลาใดเวลาหนึง่
3
RNA synthesis (transcription)
Size
RNA < DNA
Largest
RNA mol
= 50,000 nucleotides
Smallest DNA mol = 45,000,000 bp.
RNA
single strand
(mRNA, tRNA, rRNA)
snRNA
scRNA
snoRNA
miRNA
4
RNA synthesis ต ้องการ
1. DNA template
2. ribonucleoside triphosphate
(ATP, GTP, CTP, UTP)
3. DNA dependent RNA polymerase
4. Mg2+, Mn2+ ไม่ต ้องการ primer
5
Transcription is initiated at promoter sites
on the DNA template
กระบวนการ transcription เริม
่ โดย RNA
polymerase มาจับบนสายของ DNA ทีบ
่ ริเวณ
promoter ซงึ่ เป็ นตาแหน่งทีม
่ ล
ี าดับ nucleotide
ค่อนข ้างจาเพาะแน่นอน เรียกว่า consensus หรือ
conserved sequence
6
ที่ promoter อาจเป็น palindrome
sequence คือ nt สายหนึง่ จะเหมือนก ับ
nt อีกสายหนึง่ แต่อยูใ่ นทิศทางตรงก ันข้าม
GGATCC
CCTAGG
7
Prokaryotic promoter site
5'
DNA
-35
-10
TTGACA
TATAAT
template
PRIBNOW BOX
+1
START
OF RNA
Eukaryotic promoter site
5'
DNA
-75
GGNCAATCT
template
CAAT
BOX
-25
GC
+1
TATA
TATABOX
(HOGNESS BOX)
8
9
RNA polymerase ใน eukaryote ไม่สามารถ
จับบริเวณ promoter และเริม
่ การสงั เคราะห์
ั โปรตีนทีเ่ รียกว่า
RNA ได ้ด ้วยตัวเอง ต ้องอาศย
transcription factor มาจับที่ promoter
ก่อน
10
Transcription factors ของ RNA polymerase II
ั
ทีส
่ งเคราะห์
mRNA ในคน
แบ่งเป็น 2 ประเภท
1. TF ของ gene ทีท
่ าหน้าทีเ่ หมือนก ันในแต่ละ cell และทา
หน้าทีป
่ ระจาในแต่ละ cell (housekeeping gene)
้ ะถูก transcribed ตลอดเวลา เรียกว่า
gene เหล่านีจ
constitutive genes e.g. enzyme ใน glycolysis,
Krebs cycle, ETS etc.
2. TF ของ gene ทีท
่ าหน้าทีจ
่ าเพาะต่อ cells, tissues
้ ะถูก transcribed ใน cells และ tissues
gene เหล่านีจ
บางชนิดเฉพาะเวลาทีจ
่ าเป็น และในบางเวลาของการ
พ ัฒนาการเท่านน
ั้
11
-Transcription factors interact with
eukaryotic promoters : TF I , II
ต ัวอย่าง
Sp 1- 95 Kd or 105 Kd protein from mammalian cells
- required for transcription of genes whose
promoters contain GC boxes
12
CTF - CCAAT binding transcription factor
- 60 Kd
- bind to the CAAT Box
B-protein - bind to TATA box
Heat-shock transcription factor
gal 4 protein : - bind ก ับ upstream sequence
ของ promoter ของ gene ที่
encode enzyme ในการ
metabolize galactose
13
14
ั้ ง
นอกจาก promoter แล้ว DNA ของ eukaryotes ชนสู
่ นทีท
มีสว
่ าหน้าทีค
่ วบคุม transcription ทีเ่ รียกว่า
transcription elements e.g. enhancer,
silencer และ response element
enhancer : - DNA sequence ทีเ่ พิม
่ rate ของ
initiation ของ transcription โดย
RNA pol II
- อาจอยูท
่ ี่ upstream, downstream หรือ
กลาง gene ทีถ
่ ก
ู transcribed
15
silencer : DNA sequence ทีล
่ ด หรือย ับยงั้
transcription
response elements : DNA sequence สาหร ับ
จ ับก ับ transcription factor ทีถ
่ ก
ู คุมโดย
่ cyclic AMP
signaling molecule เชน
response elements
16
Hormonal action of glucocorticoids
enhancer
Inactive gene
promoter
hormone-receptor
complex
mRNA synthesis
promoter
activated
enhancer
+
active gene
17
RNA polymerase
upstream
DNA
sense strand (+)
downstream
5-ATG-TCC-GCA-CGG-CCT-3
3-TAC-AGG-CGT-GCC-GGA-5
antisense (template) strand (-)
transcription
RNA
5 -AUG-UCC-GCA-CGG-CCU-3
translation
+
Protein NH3-Met-Ser-Ala-Arg-Pro-CO2
amino
carboxyl
terminus
terminus
18
RNA polymerase
Prokaryotic cell
Eukaryotic cell
RNA polymerase
I, A
II, B
III, C
มี
มี
1
3
ชนิด
ชนิด
Location
Product
nucleolus
nucleoplasm
nucleoplasm
rRNA
mRNA
tRNA
(5S rRNA)
sn RNA, sc RNA
mitochondria
RNAs
in mito.
REMOTE
19
DNA dependent RNA polymerase
-form phosphodiester bond
ทิศทาง 5
3
-มี 6 subunits α2 ββ σω
α2 ββ = core enzyme
σ sigma factor
20
σ เป็นต ัวกาหนดจุดเริม
ั
่ ต้นสงเคราะห์
บน DNA template
และจะเข้ามารวมก ับ core enzyme เมือ
่ เริม
่ ต้นการ
ั
สงเคราะห์
RNA
ั
เมือ
่ สงเคราะห์
ได้ RNA strand ยาว  10 nucleotides
ก็จะแยกจาก core enzyme
α
β
β'

ω
- binds regulatory sequences
- forms phosphodiester bond
- binds DNA template
- recognizes promoter and initiates synthesis
- unknown
21

DNA
2
first nucleotides ATP, GTP
5'
2 (core enzyme)
RNA synthesis
1.
2.
3.
4.
initiation
elongation
termination rho factor[]
release
22
23
Stem-loop structure
24
Termination of transcription
ppp5
RNA polymerase
Rho
protein
ATP
+
H2O
ADP
+
H2O
25
Termination of transcription
Sequences in DNA
1. unique - nonrepetitive code สาหร ับ
protein 2% ของ genome
2. moderately repetitive <106
copies/haploid กระจายอยู่ ใน unique
sequence
3. highly repetitive 5-500 bp,  1-107
copies/haploid
26
Coding Intervenin
region g sequence
3
DNA
strand
5
RNA
transcript
Poly A
Cap
mRNA
Spliced mRNA
translation
Polypeptide
chain
H 2N
COOH
27
ั
mRNA ทีส
่ งเคราะห์
จาก DNA เป็น primary
transcriptเรียกว่า heterogeneous nuclear RNA
(hnRNA) ต่อมาจึงมี posttranscriptional
processing ก่อนผ่านออกจาก nucleus
28
Posttranscriptional processing of mRNA
M7
5
guanosine
(G)
A M
P P P
M6
poly A  200
3
1. nucleotide ต ัวแรกมี base เป็น A หรือ G
2. มี poly A (200 AMP) มาต่อทาง 3 –OH
3. ทาง 5 –P จะมี guanosine มา capped
4. มี methylation ที่ M7G และ M6A และ methylate
ribose-2 ของ A (or G) (& อาจที่ nucleotide ต ัวถ ัดไปด้วย)
ื่ ม exon เข้าด้วยก ัน (splicing)
5. ต ัดสว่ นทีเ่ ป็น intron ออก และเชอ
29
Posttranscriptional processing
30
ั
Splicing ต้องอาศยโมเลกุ
ลของ RNA ขนาดเล็กที่
อยูใ่ น nucleus และ cytosol
- small nuclear RNA (snRNA) และ
- small cytoplasmic RNA (scRNA)
ซงึ่ RNA เหล่านีม
้ ก
ั จะอยูร่ วมกับโปรตีนเป็ น
- small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs,
snurps) และ
- small cytoplasmic ribonucleoprotein particles
(scRNPs, scurps)
31
snRNP (size)
U1 (165nt)
U2 (185nt)
U5 (116nt)
U4 (145nt)
U6 (106nt)
Role
binds the 5 splice site and then the 3 splice
site
binds the branch site and forms part of the
catalytic center
binds the 3 splice site
masks the catalytic activity of U6
catalyzes splicing
complex U1, U2 + mRNA precursor + U4-U5-U6 complex
spliceosome (60S complexes)
32
exon1
Pre-mRNA
5
AG GU
intron
OH 2′
***ApG
pGpUp
pGpUpRpApYp
1
U1
5′splice
site
***ApG
+
3
U5
U4/6
Intron
OH 3′
exon2
ApG
U2
 
exon1
5
AG
(2 ,5 )
pGpUpRpApYp
3′splice
site
exon2
ApG
3
2
spliced
junction
 
(2 ,5 )
pGpUpRpApYp
exon1
ApG OH 3′
excised intron in lariat form
+
+
5
exon2
3
***ApG
spliced exons
Complex U1 ,U2 + mRNA precursor + U4 –U6-U5 complex
Spliceosome (60s complex)
33
Splice sites in mRNA precursor are specified by sequences at
the end of introns.
Branch site
5 AGGUAAGU
A
CAGG 3
intron
Splicing :
snRNPs
ATP
spliceosome
SLE : systemic lupus erythematosus
results from autoimmune response in which patients
produces Ab against snRNPs
34
1
2
3
4
5
Constitutive Splicing
1
2
1
1
3
4
2
2
3
4
5
AAAAAAA
5
4
hn RNA
All splice
sites used
5
AAAAAA
Segment 3 deleted by Alternative Splicing
35
1
2
3
4
a
5
b
hn RNA
Poly A addition signals
1
2
3
4
1
2
3
4
AAAAAA
5
Site a used
AAAAAA Site b used
Alternative tailing
36
Aberrant splicing
Thalassemia
บางชนิด
mutation G
A (19nt away from normal 3 splice
site of first intron)
new 3 acceptor site (splice site)
Aberrant protein
37
Normal
Normal 3 end of intron
5 CCTATTGGTCTATTTTCCACCGTTAGGCTGCTG 3
-thal
5 CCTATTAGTCTATTTTCCACCGTTAGGCTGCTG 3
38
e.g. apolipoprotein B mRNA editing protein
human plasma : apo B
2 isoproteins
apo B 100, apo B 48
synthesized from a single gene by mRNA editing
mechanism
39
apo B100 in liver
apo B 48 in intestine
is translated from a full-length
14.1 kb mRNA
is synthesized from an apo B
mRNA containing premature
inframe translational stop
codon
CAA
UAA
40
Lipoprotein assembly
LDL receptor binding
1
Apo B 100
4536
512kd
Translation
5
CAA
Unedited mRNA
NH4
5
RNA editing by deamination
UAA
Edited mRNA
1
Apo B 48
3
3
Translation
2152
240 kd
41
5S ได ้จาก 5S rRNA precursor
5.8S, 18S, 28S ได ้จาก 45S rRNA precursor
3
5
5S rRNA
precursor
121 nucleotides
45S rRNA
precursor
18S
5.8S
28S
42
23 S RNA 5S RNA
~34 proteins
50S
70S
30S
16 S RNA
~21 proteins
Eukaryotic ribosome
60S
80S
40S
28S RNA 5.8S RNA 5S RNA
~50 proteins
18S RNA
~30 proteins
43
: The discovery of catalytic RNA
Thomas Cech
26S rRNA precursor from Tetrahymena
5
self splicing
spliced exon
5
5'
G
exon
OH
intron
exon
3
catalytically active
G
OH
3
+
G
3
G
OH
5
L19
RNA
3
L-19 IVS – nuclease and polymerase
5
3
44
RNA ทีม
่ อ
ี ณู เล็กทีส
่ ด
ุ 4S (73-93 nucleotides) มี 50+ ชนิด
(for 20 aâ)
tRNA ทีท
่ าหน ้าทีจ
่ ับกับ amino acid ชนิดเดียวกันเรียกว่า isoaccepting tRNA
่ methylation, deamination
มี modified base เชน
3
5
ribonuclease P
5 G
exonuclease
5
G
3
A
C
C
C-C-A 3
CTP, CTP, ATP
anticodon จ ับก ับ codon บน mRNA
45
46
1.
2.
รวมก ับ DNA template
ย ับยงั้ RNA polymerase
1.
รวมก ับ DNA template
1.1 Intercalation
Actinomycin D (between 2G-C base pairs)
inhibit transcription > replication : daunomycin, doxorubicin,
mithramycin, ethidium bromide
1.2 Cross-link
Alkylating agents – nitrogen mustard, mechoethamine etc.
form cross link ระหว่าง 2 guanines (N7) ทีอ
่ ยูค
่ นละสาย
47
2.
ย ับยงั้ RNA polymerase
2.1 Rifamycin, rifampicin
inhibit RNA polymerase (initiation) ของ prokaryote,
inhibit only mitochondrial RNA polymerase ของ eukaryote
2.2 -Amanitin
Amanita phalloides
inhibit mammalian nuclear RNA polymerase II
2.3 Streptolydigin
inhibit RNA elongation
48