Transcript Purificación de proteínas

Aislamiento del producto
Luego de la formación del producto de
interés procederemos a su aislamiento.
En este caso particular consideramos como
producto:
Proteína
CAROLINA VITA
Aislamiento de una proteína

Se requiere conocimiento de la proteína
– De que tipo de célula proviene
– De que parte de la célula
– Qué hace esa proteína

Particularmente útil si se conoce :
– Tamaño
– Composición
Aislamiento de una proteína
Selección de la fuente proteica
Ej: de tejidos de animalales como pollos,
cerdos, vacas, ratas son los elegidos
Distribución de la proteina (mayor concentración)
 Ej: microorganismos
1. bacterias: E. coli
2. Levaduras: Saccharomyces cerevisiae

Tecnicas de clonado molecular

Métodos de solubilización
Es el primer paso obligado de la
purificación 
la proteína debe estar en
solución
Estabilizacón de la proteina
Existencia de agentes que provocan un daño
irreversible
 pH
 T
 Proteasas
 Interfase agua–aire
 Adsorción a la pared de los recipientes
 Crecimiento de microorganismos
En el caso de proteína intracelular  muy
baja concentracion y acompanada de
millares de proteinas y otras
macromoleculas
 En el caso de proteínas extracelulares
pueden estar en baja concentración y
también acompañada o ser el principal
producto extracelular

Estrategia

Remover del organismo la proteína pura
en la menor cantidad de pasos con la
menor pérdida de actividad posible
Objetivo

Purificación de una proteína de interés
Para ello se cuenta con métodos de
purificación
 Los métodos se utilizan en etapas
 Serie de pasos independientes que utilizan
las caracteristicas fisicoquimicas de las
proteínas para separarlas de otras
proteínas o de otras sustancias
Metodos de purificación
Basado en las siguientes propiedades proteicas:
Tamaño
 Solubilidad
 Carga
 Adsorción
 Afinidad

Procedimientos
Característica
Dialisis – ultrafiltración
Electroforesis en gel
Cromatografia de exclusión molecular
Ultracentrifufacion
Tamaño




Solubidad
 Precipitación con Sales

“
Solventes organicos

‘’
por pH
Polaridad




Carga
Selectividad
Cromatografia de absorción
C. En papel
C. En fase reversa
C. De interaccion hidrofóbica
 Cromatografia de intercambio iónico
 Electroforesis
 Isoelectroenfoque

Cromatografia de afinidad
Tamaño
Diálisis
Utiliza membrana semipermeable donde


moleculas de agua y las de solutos
pequeños la atraviesen
LAS
PROTEÍNAS
SON
RETENIDAS
Diálisis
Tamaño
Ultrafiltracion
Se utiliza una membrana semipermeable
que retiene las proteínas
La presión o fuerza centrífuga se usa para
separar por filtración el medio acuoso y
las moléculas de tamaño pequeño
• Uso de celofán o membranas
Centrifugación
Método separación y análisis
Centrifugation en gradiente de densidad
Gradientes continuos de sacarosa tubo de
centrifuga
Recuperación del materia:
Se perfora el tubo o bien se congela y se
corta en capas

Centrifugación
Los componentes de la mezcla se separan
por:
 Peso
 Tamaño
 Densidad
 Forma
Coeficiente de sedimentación
S=
M (1-V)
Nf
M: peso molecular
V: Volumen espécifico
: densidad de la solución
N : numero de avogadro
F: coeficiente de fricción
Las proteínas migran de forma proporcional
a este coeficiente
Solubilidad
Muy utilizados en los primeros pasos de la
purificación
 Mantiene nativa a la proteina
 Redisolucion sin perdida de actividad

Solubilidad
Proteina composicion de aa  le otorga un
comportamiento diferente
La solubilidaad de la proteína depende:

 Interacción
intraproteina
 Interaccíon proteína-proteína
 Interacción proteína- disolvente
Solubilidad
Interacciones mencionadas dependen de:
pH
 Fuerza iónica
 Disolvente
 Temperatura

Solubilidad-pH
La carga neta de las proteína depende del
contenido de aa ácidos y de aa básicos
El valor del pH donde la carga neta de la
proteína es cero  pI (punto isoelectrico)
Solubilidad es mínina
Ej: contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)
Solubilidad-pH
Solubilidad-Fuera iónica


Salting in
Salting out
Salting in

Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)
aumenta con la [ sales]  Salting in
Al aumentar la [sales]
proteina se rodea de contraiones
más soluble por > interacción proteína-solvente
Las proteínas en H2O tienden a formar
COMPLEJOS electrostáticos  precipitan
Salting out

La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a
0.02 M) disminuye con la [sales] 
Salting out
Sales capturan el H2O > interacción prot-prot
La alta [sal] remueve la esfera de
solvatación de la proteína
Solubilidad-Disolventes
Adición de disolventes neutros miscibles
en agua (ACETONA, ETANOL)
 Se usan en distintas proporciones
 Bajan el poder de solvatación de las
soluciones acuosas

Solubilidad- Temperatura
0-40 oC
>T > solubilidad.
 40-50oC
 inestabilidad
DESNATURALIZAN ( solubilidad)
