Transcript Document 7757979

ELECTROFORESIS
Movimiento de partículas
cargadas por acción de un
campo eléctrico
MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA
Estado estacionario:
q.E = f.v
v (cm/seg) = me.E
me = v/E = d/t.E
(f: coef. de fricción)
q.E = 6r.v
q.E = 6rme.E
me = q / 6r
FACTORES QUE AFECTAN LA
ELECTROFORESIS
CAMPO ELECTRICO
Voltaje
Potencia
Intensidad
Resistencia
Temperatura
DESARROLLO
ELECTROFORETICO
ELECTROFORESIS:
FACTORES ELÉCTRICOS
F = q.E
fuerza electromotriz = trabajo
E = I.R
P = dW/dt
Desarrollo
electroforético:
• Voltaje constante
• Corriente constante
P = E.dq/dt = E.I
trabajo por unidad de tiempo =
POTENCIA
• Potencia constante
ELECTROFORESIS
Efecto del sobrecalentamiento
P = dH/dt
energía convertida en calor
En un sistema de resistencia R:
P = I2.R = I.V
Causas de
sobrecalentamiento:
I
V
RoC
EFECTOS:
•  me
• R
•  difusión
• CI
•  corrientes convectivas
• desnaturalización  pérdida
de actividad enzimática o
inmunológica
• otras
FACTORES QUE AFECTAN LA
ELECTROFORESIS
CAMPO ELECTRICO
Voltaje
Potencia
Intensidad
Resistencia
Temperatura
BUFFER
pH
Fuerza Iónica
DESARROLLO
ELECTROFORETICO
Interacciones iónicas
ELECTROFORESIS: Efecto de la fuerza
iónica de la solución reguladora
• Estado estacionario: atmósfera iónica
esférica
• Cuando se aplica E: deformación de
la simetría esférica con
desplazamiento del centro de carga de
la atmósfera iónica.
• Efecto de arrastre, la atmósfera
iónica se mueve en dirección opuesta
a la del ion central. Reducción de la
carga neta efectiva.
me  (1/)1/2
ELECTROFORESIS
EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA
DE LA SOLUCIÓN REGULADORA
Fuerza iónica baja:
Fuerza iónica alta:
•  C   I  permite
> V  < tiempo 
< difusión
•
•
•
•
•
 capacidad buffer 
modificaciones de pH
 disolución
 difusión
 capacidad buffer
 C  I  debe aplicarse
< V  > tiempo
µ  0,02 - 0,1 M
ELECTROFORESIS
Efecto del pH de la solución reguladora
• Modificación de la carga eléctrica de las
proteínas
• Sentido de la electroforesis
LIMITACIONES:
• Cambios en la solubilidad de los compuestos
• Desnaturalización de proteínas
• Alteración de las propiedades inmunológicas
y/o enzimáticas
FACTORES QUE AFECTAN LA
ELECTROFORESIS
CAMPO ELECTRICO
Voltaje
Potencia
Intensidad
Resistencia
Temperatura
BUFFER
pH
Fuerza Iónica
DESARROLLO
ELECTROFORETICO
MEDIO SOPORTE
Adsorción
Electroendósmosis
Tamiz Molecular
MEDIOS SOPORTE: Materiales insolubles en sistemas
acuosos, utilizados para disminuir las corrientes convectivas
EFECTOS QUE INTRODUCEN EN LOS PROCESOS ELECTROFORETICOS
•
•
•
•
•
Adsorción en el medio
Inhomogeneidad de la matriz del material
Electroendósmosis
Difusión
Efecto tamiz molecular
CONSIDERACIONES PARA SU ELECCION
•
•
•
•
•
Poder resolutivo
Limitación de la magnitud del campo eléctrico
Facilidad de manipulación, tinción y decoloración
Posibilidad de valoración cuantitativa de los resultados
Costo
MEDIOS SOPORTE PARA ELECTROFORESIS
 Membranas de acetato de celulosa
 Geles: almidón, agar, agarosa, poliacrilamida
 Otros: Papel, Sephadex, polvo de celulosa, sílica gel, óxido de Al
Electroendósmosis
Formación de doble capa eléctrica
E = 0:
• Asociación anión-contraión,
ambos hidratados.
E  0:
• Aniones inmóviles.
• Desplazamiento de cationes
hidratados.
• Efecto: flujo neto de
líquido que se desplaza
hacia el cátodo
MEMBRANAS DE ACETATO DE CELULOSA
ESTRUCTURA
 Inerte. Frágil y sensible a solventes
FACTORES DIFERENCIALES
• Longitud de la cadena de celulosa
• Grado de acetilación (1- 40 %)
• Tamaño y distribución de los poros
• Volumen de los poros comparados con la matriz sólida (20-85%)
• Agentes hidratantes y grado de hidratación del acetato de celulosa
• Compuestos residuales del proceso de acetilación
CONDICIONES DE TRABAJO
• Proceso de humectación previo para permitir que los poros sean
lubricados por la solución buffer (equilibrio)
UTILIDAD
• Buenas separaciones a bajo voltaje y en tiempos cortos
• Posibilidad de revelados diferenciales
• Puede ser transparentizado blanqueado o disuelto para el análisis por
densitometría o eluido de las fracciones
FACTORES QUE AFECTAN LA
ELECTROFORESIS
CAMPO ELECTRICO
Voltaje
Potencia
Intensidad
Resistencia
Temperatura
BUFFER
pH
Fuerza Iónica
DESARROLLO
ELECTROFORETICO
MEDIO SOPORTE
Adsorción
Electroendósmosis
Tamiz Molecular
MUESTRAS
DESARROLLO ELECTROFORÉTICO
Muestras
Medio soporte
Buffer
Condiciones eléctricas
DESARROLLO ELECTROFORETICO
DETECCION
Fijación
Tinción general
Tinción específica
Actividad enzimática
Actividad inmunológica
Detección de marcación previa
Western blot
ELECTROFORESIS: TINCIONES
COLORANTE
ESPECIFICIDAD
SENSIBILIDAD
COMENTARIOS
Amido Black o Negro
Amido 10B o Amido Schwartz
Tinción general
Sensibilidad: 1 g/banda
Mejora con fijación previa .
Diferente grado de unión según la
proteína.
Diferente grado de unión según la
proteína. Tinción estable.
Apropiado para densitometría.
Coomassie Blue R-250
Tinción general
Sensibilidad: 0,2-0,5 g/banda
Xylene Cyanine Brilliant G o
Coomassie Blue G-250
Tinción general
Aumenta la sensibilidad x3 en TCA Apropiado para densitometría.
después de la tinción
Verde Lisamine
Tinción general
Rojo Ponceau 2S
Tinción general. Sensibilidad:
alreddor de 0,5 g/banda
Tinciones con plata y
combinaciones con
otros colorantes
Sensibilidad: 100 veces > tinciones Laborioso. Varios protocolos.
generales
Polisacáridos y DNA.
No reaccionan todas las
proteínas.
Tinción más uniforme con todas
las proteínas séricas.
DENSITÓMETRO
Zona Prealbúmina
Zona Albúmina
Zona Alfa 1
Zona Alfa 2
Zona Beta 1
Zona Beta 2
Zona Gamma
DENSITOMETRÍA CORRESPONDIENTE
A EUPROTEINEMIA
PROTEINAS
COMPONENTES DE FRACCIONES ELECTROFORÉTICAS
ZONA PREALBÚMINA
PREALBÚMINA (TTR, transtiretina: 54.000; 4,7): transporta tiroxina y triyodotironina
PROTEÍNA LIGANTE DE RETINOL (RBP: 21.000): en complejo con prealbúmina transporta
vitamina A
Indicadores de malnutrición y enfermedad hepática.
ZONA ALBÚMINA
ALBÚMINA (66.000; 4-5,8): Gran capacidad de transporte por la elevada concentración y la
cantidad de cargas negativas: une bilirrubina, ácidos grasos, hormonas (tiroxina,
triyodotironina, cortisol, aldosterona, drogas, calcio).
Mantenimiento de la presión oncótica del plasma. Indicador de estado nutricional.
MOVILIDAD ALFA 1
1-ANTITRIPSINA (AAT: 55.000; 4,8): Reactante de fase aguda con actividad antiproteasa
(actúa contra quimotripsina, calicreína, renina, uroquinasa, plasmina, elastasa y colagenasa).
Constituye casi el 90% de la banda proteica de la zona.
1-GLICOPROTEINA ACIDA (40.000; 2,7-4,0): Asociada con inflamación.
1-FETOPROTEINA (69.000): Mayoritaria en la circulación fetal. En el adulto, marcador de
carcinoma hepatocelular.
1-LIPOPROTEINA (HDL, 200.000): Transportadora de lípidos (Apo A).
MOVILIDAD ALFA 2:
HAPTOGLOBINA (Hp: 80.000-400.000): Transportadora de oxihemoglobina en plasma.
Proteína de fase aguda.
2-MACROGLOBULINA (AMG: 800.000; 5,4): En forma de AMG-complejos con proteasas
(plasmina, pepsina, tripsina, quimotripsina) impide la proteolisis de compuestos de gran
tamaño.
CERULOPLASMINA (CER: 134.000; 4,4): Transportadora de cobre, cataliza procesos
oxidativos. Proteína de fase aguda.
VLDL-LIPOPROTEÍNA: relación con TG endógenos (zona pre-beta).
MOVILIDAD BETA 1:
TRANSFERRINA (SIDEROFILINA: 77.000; 5,7): Transportadora de hierro (es capaz de unir
otros iones metálicos).
HEMOPEXINA (57.000): Une hemo.
-LIPOPROTEINA (LDL, 3.000.000): Transportadora de lípidos.
C4 (206.000): Factor del sistema de complemento. Proteína de fase aguda.
MOVILIDAD BETA 2:
FIBRINOGENO 340.000; 5,5): Proteína de fase aguda. Precursor del coágulo de fibrina.
2-MICROGLOBULINA (11.800): Cadena liviana de los antígenos de histocompatibilidad de
leucocitos. Marcador de insuficiencia funcional renal.
C3 (180.000): Factor de complemento. Proteína de fase aguda.
MOVILIDAD GAMMA
PROTEINOGRAMAS
Normal - Inmunoglobulinas monoclonales
Hiperinmunoglobulinemia policlonal - Fase aguda