MICROSCOPIA

 Un microscopio es un instrumento que amplifica una imagen  Es la resolución y no el aumento la que dicta los límites que pueden ser observados.

 Para el M óptico los límites de resolución están en 0.2um y para el M electrónico los límites aumentan hasta 1000 veces  La capacidad de aumento de un M compuesto se calcula multiplicando el aumento del objetivo por la del ocular  El poder de resolución está en función de la longitud de onda de la luz y de la apertura numérica propiedad de la lente que integra el objetivo  La mayoría de los microscopios tienen oculares de 10 a 15X y objetivos de 10 a 100X. Con los objetivos de 100X se usa el aceite de inmersión.

TIPOS DE MICROSCOPIOS

 Entre los microscopios ópticos : campo claro, contraste de fases, Normarski contraste de interferencia diferencial (DIC) , campos oscuro y fluorescencia  Microscopía electrónica : de transmisión (TEM) y de barrido (SEM)

MICROSCOPIO OPTICO DE CAMPO CLARO Y OSCURO

 En el M de campo claro la muestra debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz  Se deben usar métodos de tinción ya que el campo claro no produce contraste  En el M de campo oscuro la única luz que entra en el objetivo es la dispersada por la muestra  Los organismos se ven brillantes sobre fondo oscuro y es útil para estudiar la motilidad de los organismos

 El contraste de fases se basa en que las células poseen diferentes índices de refracción y producen un desvío de los rayos de luz que da lugar a una imagen oscura sobre fondo brillante  El contraste de interferencia diferencial (DIC) o Normarski usa dos rayos de luz polarizada y las imágenes aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado  El M de fluorescencia se usa para muestras capaces de emitir fluorescencia emitiendo luz dentro del espectro visible cuando es expuesta a la luz UV

DIC FLUORESCENCIA

MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Células epiteliales triple coloración: núcleo (azul), microtúbulos (verdes), actina (rojo) 200X 1000X

MICROSCOPIO ELECTRONICO

 Para estructuras internas se usa el TEM que usa electrones en vez de rayos de luz en cortes ultrafinos nucleicos para ver ácidos y proteínas  Para mejorar el contraste se tratan con acido ósmico, lantano, uranio o plomo  Para estructuras externas se usa el SEM cubriendo la muestra con una capa de oro.

 El haz de electrones del SEM barre la superficie y los electrones desviados son proyectados en una pantalla para producir una imagen  Se pueden obtener rangos de amplificación de 15X a 100000X en la superficie de los objetos

FLUOROCROMOS

 DAPI  Naranja de acridina  Rojo Texas  Ioduro de Propidio  FITC  Autofluorescencia  Rodamina

¿Para qué el microscopio?

¿Resolución del ojo humano?

¿Resolución del ojo humano?

Aproximadamente 1/10 milímetros

¿Cuál es el tamaño de una

Escherichia Coli

?

1x3 mm 1X3 µm 1x3 nm

¿Cuál es el tamaño de una

Escherichia Coli

?

1x3 mm 1X3 µm 1x3 nm

¿y de una célula animal típica?

1 µm 10 µm 100 µm

¿y de una célula animal típica?

1 µm 10 µm 100 µm

Morfología microscópica de microorganismos.

Existen tres formas básicas:  Esféricas (cocos)  Bastoncitos o cilíndricas (bacilos)  Helicoidales (espirilos)

La morfología bacteriana se puede observar de dos maneras

En estado vivo.

Muertas y coloreadas

Técnicas de tinción:

Los colorantes se clasifican en: 

Básicos o Catiónicos

. (azul de metileno, safranina, cristal violeta ) 

Ácidos o aniónicos

. (eosina, fucsina ácida y rojo congo)

Clasificación de las tinciones:

Negativas.

 Tinta china, Nigrosina.

Positivas:  Simple (azul de metileno)  Diferenciales (Tinción de Gram)  Estructurales (capsulas, esporas ,flagelos)

Tinción de Gram

1884 Cristian Gram Es una tinción diferencial Diferencia Gram+ de Gram -.

PASOS DE UNA TINCIÓN TINCIÓN DE GRAM

 Hacer el extendido y dejar secar  Fijar la muestra con metanol o calor por flameado  Agregar cristal violeta y esperar 1 min, todas las células se teñirán de color azul púrpura  Enjuagar con agua  Agregar lugol (I 2 30 seg y 3 min / IK) y esperar entre  Enjuagar con agua  Agregar acetona/ alcohol y esperar entre 15-20seg  Enjuagar con agua  Tinción de contraste con safranina o fuscina básica , esperar 1-2 min

Bacterias de

Clostridium perfringens

(Gram positivas)

Tinción de Gram

 Bacterias de

Escherichia coli

(Gram negativas)

Gram + / Gram -

Otras Tinciones:

Tinción de ácido-resistencia

: Detecta bacterias acido resistentes saprófitas (

Mycobacterium tuberculosis

) (fucsina fenicada)

Tinción de esporas/ Schaeffer y Fulton

:

Bacillus y Clostridium

(verde de malaquita)