Transcript Inmunoréplica tipo Western

Mayo, 2013
Dra. Sobeida Sánchez Nieto
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Es una técnica analítica que es usada para
detectar específicamente a las proteínas de
una muestra, mediante el uso de anticuerpos.
La técnica necesita la separación inicial de la
muestra a través de un un gel de
poliacrilamida en el que se separaron primero
las proteínas ya sea en base a su peso
molecular (PAGE-SDS, una dimensión) o bien
en base a su carga y peso molecular (PAGESDS; 1 o 2 dimensiones).
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Técnica que fue descrita por Southern en
1975 para la transferencia de DNA en geles
de agarosa a membranas de nitrocelulosa.
Después se utilizó para la transferencia de
RNA a membranas, Northern.
Finalmente se transfirieron proteínas a
membranas, Western.
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Separación de proteínas en gel de
poliacrilamida.
Transferencia de las proteínas a la matriz
sólida (membrana)
Tinción de proteínas en la membrana
(opcional)
Bloqueo
Detección de la proteína de interés:
a. Reacción con el primer anticuerpo
b. Reacción con el segundo anticuerpo
Hay dos tipos de aparatos y por tanto de
dos formas diferentes para transferir proteínas
del gel al soporte sólido:
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transferencia húmeda, en aparatos que poseen
cámaras que se llenan de amortiguador y
transferencia semiseca, en aparatos que no
tienen dichas cámaras y por tanto no necesitan
tal cantidad de amortiguador.
1
2
1
2
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Amortiguador de transferencia:
25 mM Tris, 190 mM glicine, 20% MeOH, pH 8.0.
Cuando son proteínas de alto peso molecular
añadir 0.05% SDS.
Corriente y tiempo aplicado para la transferencia en cámara húmeda
Peso molecular
Condiciones 1
Condiciones 2
< 20 kDa
1 A /45 min
250 mA/ 3 h
<120 kDa
1 A/60 min
250 mA/ 4 h
>120 kDa
1A / 90 min
250 mA/ 6 h
>250 KDa
1A /105 min
500 mA/3.5 h
Polo positivo
Ojo! polo negativo
Añadir buffer
Colocar en agitación
Proteínas
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Verificar que las proteínas fueron transferidas a
la membranas.
Determinar si los carriles fueron cargados de
manera similar.
Evaluar la eficiencia de la transferencia.
Identificar bandas de proteínas para enviar a
secuenciar.
Hay muchos tipos de tinciones posibles,
incluyendo colorantes orgánicos como Rojo de
Ponceau, amido black, fast green, azul de
Coomasie, colorantes fluorescentes y particulas
coloidales (oro, plata, cobre, hierro)
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Si la membrana se usa para tinción colorimétrica (segundo
anticuerpo) usar la tinción reversible de Rojo de Ponceau S.
Tinción en la que una solución 0.1% de Rojo de Ponceau en
5% ácido acético se deja por 5 min.
Se visualizan las bandas de proteína.
Remover el colorante lavando con agua hasta que las bandas
desaparezcan (se puede añadir 0.1 M NaOH), lavar y luego
bloquear.
Calf liver proteins were visualized after electroblotting to Immobilon-P membranes: (A)
Transillumination, (B) Coomassie™ Brilliant Blue, (C) Ponceau-S red, (D) Amido black and (E)
CPTS total protein stains. Left to right, molecular weight standards and 12.2 μg, 6.1 μg, 3.1 μg
of the lysate per lane.
Membranes can be stored dry for long periods of time after
proteins have been transferred with no ill effects to the
membrane or the proteins (up to two weeks at 4°C; up to two
months at -20°C; for longer periods at -70°C).
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La membrana puede unir proteínas
Proteínas como los anticuerpos o las de la muestra.
Para que no haya una unión inespecífica del anticuerpo en
zonas en donde no hay proteínas (entre bandas) o bien que
se una a proteínas que no son la de interés, se debe
BLOQUEAR LA UNIÓN NO ESPECIFICA.
Para lograrlo se añade una solución diluida de proteína, la
cual se une en todos los lugares en donde no hay proteína
(allí más que en otros lados).
Por lo que el anticuerpo se une de manera preferencia a
sitios en donde hay proteína con la conformación o
aminoácidos blanco (proteína de interés).
Leche descremada, BSA, gelatina y a veces se añade Tritón
o Nonidet (ambos detergentes)
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Directa
Anticuerpo primario
Marcado
Indirecta
Anticuerpo primario
No marcado
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Múltiples bandas
en el gel en el
que se separaron
las proteínas de
las muestras
La detección de
la proteína de
interés, una sola
banda
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Segundo anticuerpo Anti-IgG de conejo
conjugado con fosfatasa alcalina
Reactivos para fosfatasa, BCIP y NBT
BC indoxyl intermediario
Precipitado
púrpura
Sal de formazán
insoluble. pp
azul